[發明專利]茉莉酸甲酯應答的人參PgPDR3基因啟動子及其應用

無效

• 申請號: 201310043896.7
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103103194A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 羅志勇;張儒;祝捷;黃景嘉;陳湘暉;李繼佳
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/10;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 中南大學專利中心 43200
• 代理人: 胡燕瑜

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一個受茉莉酸甲酯應答的人參PDR轉運蛋白基因的啟動子。

背景技術

人參（P.?ginseng?C.A.?Meyer）為五加科人參屬多年生草本植物，是名貴中藥材。人參中含有多種藥用成分，其中人參皂苷是人參最主要的活性成分。目前已從人參根中分離出50余種人參皂苷，現代醫學研究證明各皂苷單體具有重要的藥用價值，且已廣泛應用于臨床。但是其中一些具有抗腫瘤、抗衰老、抑制細胞凋亡和增強免疫力等活性強的皂苷含量極低。利用人參皂苷合成代謝相關的基因調控技術促進人參皂苷的合成與積累具有重要的理論價值和應用前景。

基因的有效轉錄和表達是發揮其基因功能的重要條件，基因成功轉錄和表達需要依靠啟動子對其的調控，啟動子與RNA聚合酶、轉錄調控因子等相互作用發揮其調控的功能。真核生物中的TATA和CAAT框，它們決定了轉錄的起始位點和效率，負責和RNA聚合酶結合，啟動基本轉錄過程。啟動子組件有許多不同的類型，包括病原誘導型作用元件、組織特異型作用元件和化學物質誘導作用元件等。其中化學物質誘導型作用元件在促進次生代謝產物合成方面起重要作用。在次生代謝產物合成與積累相關基因的表達過程中，順式作用元件通過與轉錄因子的互作發揮著重要調控作用:環境刺激經過一系列信號轉導、傳遞后，激活防衛相關轉錄因子與特異順式作用元件的互作，從而實現相關防衛功能基因的表達。鑒于順式作用元件的上述重要調控作用，使用誘導型啟動子介導的抗性基因無疑具有多方面的優勢，因此鑒定次生代謝產物合成與積累相關的誘導型啟動子已成為目前植物分子生物學研究的熱點之一。在人參次生代謝調控中，可以通過導入關鍵酶等基因調控合成途徑中的多步限速反應，或者通過順式作用元件在轉錄水平調控人參皂苷合成、轉運和積累相關基因的表達，從而提高人參皂苷的含量。

植物ABC轉運蛋白（ATP-binding?cassette?transporter）是目前已知最大，功能最廣泛的蛋白家族，ABC轉運蛋白屬跨膜運輸蛋白，利用水解ATP釋放的能量轉運有機酸、生物堿、細胞代謝產物和藥物等。參與細菌耐藥性、次生代謝產物積累、脅迫反應和腫瘤抗藥性等。ABC轉運蛋白家族包括多向耐藥性蛋白（pleiotropic?drug?resistance，PDR），多藥耐藥性蛋白（multidrug?resistance，MDR）等。PDR是其中最大的亞族，是植物和真菌中特有的一種ABC轉運蛋白。但目前對植物PDR基因相關研究甚少，離體細胞培養中，香紫蘇醇可誘導NpPDR1基因上調表達，在細胞內NpPDR1蛋白累積增強了細胞向胞外轉運香紫蘇醇以及其類似物的能力。擬南芥（A.?thaliana）細胞內香紫蘇醇的累積亦能誘導AtPDR12基因上調表達，同時在細胞外檢測到AtPDR12蛋白向胞外轉運的香紫蘇醇，推測萜類物質可能是AtPDR12基因表達的上游調控物質。矮牽牛中PhPDR1蛋白可以轉運一種新發現的植物激素——獨角金內酯，進而促進矮牽牛分枝。因而，PDR轉運蛋白基因在調控次生代謝產物的積累方面具有重要潛力。然而，在發明人的研究之前，尚無人參PDR蛋白基因及其調控元件的報道，更不存在與該基因表達調控相關的影響次生代謝產物合成與積累相關的誘導型啟動子的報道。

發明內容

本發明旨在從人參中分離出受茉莉酸甲酯應答調控的PgPDR3基因誘導型啟動子，從而提供一種能夠調控人參皂苷轉運與積累相關的基因資源，為今后開發基因工程產品奠定基礎。

為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：本發明提供了一種調控人參皂苷轉運與積累的PgPDR3基因的啟動子ProPDR3，其序列如SEQ?ID?NO.1所示，或是與SEQ?ID?NO.1具有99%以上同源性的DNA序列。

本發明所述的啟動子ProPDR3的制備方法為：提取人參根基因組總DNA，以人參根總DNA為模板，構建四個啟動子文庫：DraI文庫、EcoR?V文庫、Pvu?II文庫和Stu?I文庫；分別以構建的DraI文庫、EcoR?V文庫、Pvu?II文庫和Stu?I文庫為模板，根據人參PgPDR3基因的5′端序列設計引物，進行PCR擴增；膠回收PCR產物，該產物即得本發明所述的ProPDR3啟動子。