[發(fā)明專利]鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌特異性巢氏PCR檢測(cè)方法及所用引物

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310043895.2
• 申請(qǐng)日: 2013-02-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103131698A
• 公開(kāi)（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡秀芳;周曉風(fēng);于婕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的特異性巢氏PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

作為地球上最古老的生物，在38億年的進(jìn)化歷史長(zhǎng)河中，微生物與植物形成了超級(jí)共生體，雙方通過(guò)基因與信息交流，微生物與植物的進(jìn)化、生長(zhǎng)繁殖、免疫、抗逆及次生代謝等產(chǎn)生了千絲萬(wàn)縷的聯(lián)系。作為植物的“第二基因組”，微生物通過(guò)固氮、分泌激素、分解有機(jī)物及促進(jìn)水分和礦質(zhì)元素的吸收等多種途徑促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。內(nèi)生菌還能分泌抗生素類(lèi)物質(zhì)，或直接產(chǎn)生活性成分而促進(jìn)藥用植物的品質(zhì)形成。因此，微生物生態(tài)與藥用植物的產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)，微生物生態(tài)被認(rèn)為是藥材道地性的重要成因之一。因此，微生物生態(tài)檢測(cè)是衡量中藥材的生長(zhǎng)狀況和品質(zhì)控制的重要指標(biāo)。

目前，微生物生態(tài)研究可采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)及分子生物學(xué)方法。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法由于只能培養(yǎng)1%左右的微生物，因此在微生物生態(tài)研究中往往作為一種輔助方法；基于16S?rRNA基因的分子生物學(xué)是微生物生態(tài)研究的主要手段。根據(jù)“內(nèi)共生假說(shuō)”，植物中的葉綠體及線粒體均由細(xì)菌進(jìn)化而來(lái)，葉綠體及線粒體的16S/18S?rRNA與細(xì)菌16S?rRNA具有較高的同源性，因此研究植物內(nèi)生菌必須設(shè)計(jì)特異性引物以區(qū)分葉綠體16S?rRNA和線粒體18S?rRNA基因。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的特異性巢氏PCR檢測(cè)方法及所用引物，本發(fā)明解決了現(xiàn)有通用引物無(wú)法區(qū)分細(xì)菌的16S?rRNA與植物葉綠體16S?rRNA和線粒體18S?rRNA這一難題。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種巢式PCR擴(kuò)增引物，包括第一次PCR擴(kuò)增引物和第二次PCR擴(kuò)增引物，

第一次PCR擴(kuò)增引物為：

fM1：5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’，

rC5：?5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’；

第二次PCR擴(kuò)增引物為：

GC夾-f515：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGT?GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

rC5：?5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述巢式PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行的鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的特異性巢氏PCR快速檢測(cè)方法，包括如下步驟：

1）、鐵皮石斛總基因組DNA的提?。?/p>

2）、特異性巢氏PCR擴(kuò)增16S?rRNA基因的特定片段：

第一次PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度為50-54℃；

第二次PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度為55-59℃；

3）、DGGE分析；

將巢氏PCR的第二次擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DGGE電泳；?

4）、內(nèi)生細(xì)菌的種屬鑒定：

選擇清晰的DGGE條帶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和BLAST比對(duì)，確定其種屬特征。

作為本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的特異性巢氏PCR檢測(cè)方法的改進(jìn)：

步驟3）為：

DGGE電泳采用6%丙烯酰胺凝膠（60g丙烯酰胺溶于1000ml水而得）、30%-60%的變性劑濃度梯度；打開(kāi)電泳儀使電泳緩沖液（1×TAE電泳緩沖液）預(yù)熱60-120min至溫度為55-65℃；加40-60μ1?PCR產(chǎn)物（即，步驟2）第二次PCR擴(kuò)增所得），120-180V電泳5-10h后，將DGGE膠在EB溶液（濃度為0.5μg/ml的溴化乙錠溶液）中染色10-20?min，脫色15-30min，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

作為本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的特異性巢氏PCR檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

步驟4）為：

選擇清晰的DGGE條帶，割膠回收于1.5ml?Eppendorf管中，用無(wú)菌研磨棒研磨，加入50?μ1無(wú)菌水，37℃溫浴15-30?min，置4℃冰箱12-16h；1500~2500?rpm離心4~6min，吸取3-5?μ1上清作為模板，用引物f515和rC5進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度為54-58℃；將擴(kuò)增片段進(jìn)行克隆、測(cè)序和BLAST比對(duì)，確定其種屬特征；

引物f515：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，

引物rC5：5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

備注說(shuō)明：

本發(fā)明所涉及的引物中：N=(A/G/C/T)，R=(A/G)，B=(G/C/T)，Y=(C/T)，H=(A/C/T)；M=(A/C)。