[發明專利]鐵皮石斛內生細菌特異性巢氏PCR檢測方法及所用引物

有效

• 申請號: 201310043895.2
• 申請日: 2013-02-05
• 公開（公告）號: CN103131698A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 胡秀芳;周曉風;于婕
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/38;C12R1/01
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.巢式PCR擴增引物，其特征是：包括第一次PCR擴增引物和第二次PCR擴增引物，

所述第一次PCR擴增引物為：

fM1：5’-CCGCGTGNRBGAHGAAGGYYYT-3’，

rC5：?5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’；

所述第二次PCR擴增引物為：

GC夾-f515：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGT?GCCAGCMGCCGCGGTAA-3’；

rC5：?5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。

2.利用權利要求1所述巢式PCR擴增引物進行的鐵皮石斛內生細菌的特異性巢氏PCR快速檢測方法，其特征是包括如下步驟：

1）、鐵皮石斛總基因組DNA的提取；

2）、特異性巢氏PCR擴增16S?rRNA基因的特定片段：

第一次PCR擴增時，退火溫度為50-54℃；

第二次PCR擴增時，退火溫度為55-59℃；

3）、DGGE分析；

將巢氏PCR的第二次擴增產物進行DGGE電泳；?

4）、內生細菌的種屬鑒定：

選擇清晰的DGGE條帶，進行PCR擴增；將擴增片段進行克隆、測序和BLAST比對，確定其種屬特征。

3.根據權利要求2所述的鐵皮石斛內生細菌的特異性巢氏PCR檢測方法，其特征在于：

所述步驟3）為：

DGGE電泳采用6%丙烯酰胺凝膠、30%-60%的變性劑濃度梯度；打開電泳儀使電泳緩沖液預熱60-120min至溫度為55-65℃；加40-60μ1?PCR產物，120-180V電泳5-10h后，將DGGE膠在EB溶液中染色10-20?min，脫色15-30min，用凝膠成像系統拍照。

4.根據權利要求3所述的鐵皮石斛內生細菌的特異性巢氏PCR檢測方法，其特征在于：

所述步驟4）為：

選擇清晰的DGGE條帶，割膠回收于1.5ml?Eppendorf管中，用無菌研磨棒研磨，加入50?μ1無菌水，37℃溫浴15-30?min，置4℃冰箱12-16h；1500~2500?rpm離心4~6min，吸取3-5?μ1上清作為模板，用引物f515和rC5進行PCR擴增，退火溫度為54-58℃；將擴增片段進行克隆、測序和BLAST比對，確定其種屬特征；

引物f515：5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’，

引物rC5：5’-TAATCCTGTTTGCTCCCCAC-3’。