[發明專利]利用重組鈍齒棒桿菌以葡萄糖為底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法

有效

• 申請號: 201310043508.5
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103215198A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 饒志明;孫紅梅;徐美娟;李秀鵬;張顯
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/21;C12N15/60;C12N15/63;C12P13/00;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

利用基因工程技術，構建安全高效的鈍齒棒桿菌工程菌。該菌以葡萄糖為底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法，屬于基因工程和酶工程領域，具體涉及基因工程重組鈍齒棒桿菌生產γ-氨基丁酸的方法。

技術背景

γ-氨基丁酸是天然存在于某些生物體內的非蛋白質氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統重要的抑制性神經遞質，具有抗焦慮、降血壓、鎮定安神、增強記憶、調節激素分泌、促進生殖、利尿，鎮痛等重要生理功能。在食品、飼料、醫藥等領域具有廣泛的應用。2009年，衛生部批準γ-氨基丁酸為新資源食品，這意味著γ-氨基丁酸在國內市場跨入了一個嶄新時代。

目前，γ-氨基丁酸的制備主要通過化學合成法和微生物法，化學合成法反應條件劇烈，污染嚴重；微生物發酵法條件溫和、安全、成本較低。在微生物發酵法中，最受關注的是通過谷氨酸脫羧酶(EC4.1.1.15)催化L-谷氨酸的α-羧基脫羧來生產γ-氨基丁酸。在已報道的方法中，γ-氨基丁酸生產均需要添加外源谷氨酸作為底物，而谷氨酸是由糖質為原料經微生物發酵，采用等電點提取，離子交換樹脂分離等方法制備獲得。因而添加外源谷氨酸在一定程度上增加了γ-氨基丁酸的制備成本。

本實驗室篩選得到的一株高產精氨酸突變菌株鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum?SYP，保藏編號CCTCC?NO：M208133)，經傳代5次后，獲得菌株SYPA5-5，其生長特性等與母體菌SYP基本一致。將SYPA5-5中的argB基因敲除后，獲得基因工程菌鈍齒棒桿菌E01。該工程菌缺少γ-氨基丁酸合成途徑，但能高效轉化葡萄糖為谷氨酸。另外，本研究室前期經誘變篩選獲得一株植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)GB01-21(中國典型培養物保藏中心保藏，菌種保藏號：CCTCCM209102)，此菌株缺少谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成。

基于研究室前期研究基礎，本發明首先將精氨酸高產菌株鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑的關鍵酶基因argB敲除，獲得一株能高效轉化葡萄糖為谷氨酸的工程菌鈍齒棒桿菌E01。由于鈍齒棒桿菌缺少GABA合成途徑，本發明將植物乳桿菌GB01-21的谷氨酸脫羧酶基因克隆，于鈍齒棒桿菌E01中進行表達，獲得了一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸合成γ-氨基丁酸的高效重組鈍齒棒桿菌。實現了無需添加外源的谷氨酸，直接經葡萄糖一步法發酵合成γ-氨基丁酸，大大節約了γ-氨基丁酸的制備成本。

發明內容

本發明的目的在于：敲除鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑關鍵酶基因argB，獲得谷氨酸積累菌株鈍齒棒桿菌E01，將植物乳桿菌GB01-21的γ-氨基丁酸合成關鍵酶基因——谷氨酸脫羧酶基因進行克隆，于谷氨酸生產菌株鈍齒棒桿菌E01中異源表達，獲得一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸高效合成γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌。該重組菌實現葡萄糖到γ-氨基丁酸的一步法生產。該發明為成功整合氨基酸代謝中優質酶的生物功能，簡化γ-氨基丁酸的制備途徑，降低其合成成本提供了一條嶄新的思路。

本發明的技術方案：以基因工程為手段，構建了一株能以廉價的葡萄糖為底物，利用內源性谷氨酸合成γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌。

(1)一株能以葡萄糖為底物，高效轉化γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌，其分類命名為C.crenatum?E01/pGAD。

(2)所述重組菌的構建方法，利用攜帶抗生素抗性與條件致死型標記sacB雙標記的新型整合型載體pK18mobsacB，通過兩次同源重組敲除鈍齒棒桿菌SYPA5-5精氨酸合成途徑關鍵酶基因argB，獲得工程菌鈍齒棒桿菌E01，再將lpgad基因插入到載體pJC-tac，構建得重組質粒pGAD，電擊轉化鈍齒棒桿菌E01，通過含有30μg/mL的卡那霉素抗性篩選，獲得目的重組菌株C.crenatum?E01/pGAD；

①鈍齒棒桿菌SYPA5-5argB基因的敲除

根據GenBank中C.glutamicum?ATCC13032?argB基因序列設計argB基因上下游以及中間引物，引物序列如下：

PargBF：5’-CGCGAATTCATGAATGACTTGATCAAAGATTT

PargBR：5’-CGCGTCGACTTACAGTTCCCCATCCTTG

PΔargBR：5’-CCCATCCACTAAACTTAAACACGGTTTAGCATCTCA