[發(fā)明專利]利用重組鈍齒棒桿菌以葡萄糖為底物一步法合成γ-氨基丁酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310043508.5
• 申請(qǐng)日: 2013-02-04
• 公開（公告）號(hào): CN103215198A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 饒志明;孫紅梅;徐美娟;李秀鵬;張顯
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12N1/21;C12N15/60;C12N15/63;C12P13/00;C12P13/14;C12R1/15
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1.一株能以葡萄糖為底物，高效轉(zhuǎn)化葡萄糖為谷氨酸的基因工程菌鈍齒棒桿菌E01。?

2.權(quán)利要求1中基因工程菌鈍齒棒桿菌E01的構(gòu)建思路，其特征是利用一株高產(chǎn)精氨酸突變菌株鈍齒棒桿菌(Corynebacterium?crenatum?SYP，保藏編號(hào)CCTCC?NO：M208133)，經(jīng)傳代5次后，敲除argB基因，獲得基因工程菌鈍齒棒桿菌E01，該工程菌缺少γ-氨基丁酸合成途徑，但能高效催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為谷氨酸。?

3.一株能以葡萄糖為底物，高效轉(zhuǎn)化γ-氨基丁酸的重組鈍齒棒桿菌，其分類命名為C.crenatum?E01/pGAD。?

4.權(quán)利要求書3中的重組菌C.?crenatum?E01/pGAD的構(gòu)建思路，其特征是根據(jù)植物乳桿菌(Lactobacillus?plantarum)GB01-21(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)：CCTCCM209102)谷氨酸合成途徑，但具有較高的谷氨酸脫羧酶活力，能高效催化γ-氨基丁酸的合成，以及權(quán)利要求1中的鈍齒棒桿菌E01缺少γ-氨基丁酸合成途徑，但能高效催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為谷氨酸的特點(diǎn)，該重組菌成功重組了鈍齒棒桿菌的谷氨酸代謝途徑和植物乳桿菌的γ-氨基丁酸合成途徑，獲得能以葡萄糖為底物，生物轉(zhuǎn)化γ-氨基丁酸的高效重組鈍齒棒桿菌。?

5.權(quán)利要求書3中的重組菌C.crenatum?E01/pGAD的構(gòu)建方法，其特征是將植物乳桿菌的lpgad基因插入到載體pJC-tac，構(gòu)建得重組質(zhì)粒pGAD，電擊轉(zhuǎn)化鈍齒棒桿菌E01，通過含有30μg/mL的卡那霉素抗性篩選，獲得目的重組菌株C.crenatum?E01/pGAD。?

6.權(quán)利要求書3中的重組質(zhì)粒pGAD的構(gòu)建，其特征是將純化后的lpgad基因與pMD18-T連接，反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒pMD18-T0.5μL，目的基因4.5μL，Ligation?Solution5μL，混合連接液，將其置于16℃培養(yǎng)箱中連接4h以上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒pMD18-T-lpgad，酶切驗(yàn)證并測(cè)序，提取質(zhì)粒pMD18-T-lpgad和表達(dá)載體pJC-tac，二者同時(shí)用Sal?I/BamH?I雙酶切，酶切產(chǎn)物通過粘性末端連接，獲得重組質(zhì)粒pGAD。?

7.權(quán)利要求5中的lpgad基因的獲得，其特征是以保藏編號(hào)為CCTCCM209102的L.plantarum?GB01-21為模板，設(shè)計(jì)正反向引物lpgad?F?Sal?I和lpgad?R?BamH?I(如下所示)，以L.plantarum?GB01-21染色體為模板，lpgad?F、lpgad?R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR采用50μL體系：10×ExTaq?Buffer5μL，dNTP4μL，模板DNA1μL，上下游引物各0.5μL，ExTaq酶0.5μL，ddH₂O補(bǔ)齊至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性50s，56℃退火45s，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min，15℃10min，獲得lpgad基因，其全長(zhǎng)1400bp。?

lpgad?F?SalI：5′-CGCGTCGACATGGACCAGAAGCTGTTAAC-3′?

lpgad?R?BamHI：5′-GGCGGATCCCAGGTGTGTTTAAAGCTGTT-3′。?

8.權(quán)利要求1所述鈍齒棒桿菌E01發(fā)酵產(chǎn)L-谷氨酸的方法，其特征是：通過發(fā)酵過程不斷添加NH₄⁺源合成谷氨酸。?

9.權(quán)利要求3所述的重組鈍齒棒桿菌C.crenatum?E01/pGAD發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，其特征是：通過誘導(dǎo)使得谷氨酸脫羧酶高效表達(dá)，前期通過添加NH₄⁺源充分合成谷氨酸，后期停止NH₄⁺源的添加終止谷氨酸的合成，繼續(xù)發(fā)酵合成γ-氨基丁酸。?