[發明專利]污水處理廠聚磷菌實時熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201310042881.9
• 申請日: 2013-02-03
• 公開（公告）號: CN103146814A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 曾薇;李博曉;張立東;王向東;彭永臻
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

技術領域

本發明涉及一種污水處理廠聚磷菌實時熒光定量PCR檢測方法，屬于污水生物處理技術領域，用于對污水生物處理系統中聚磷菌的定量檢測。

背景技術

磷是導致地表水體富營養化的關鍵營養元素，世界各國都對排入地表水體的磷濃度制定了嚴格的排放標準。生物除磷技術由于經濟高效的特點已被廣泛應用于各大城市污水處理廠。雖然生物除磷技術應用于污水處理已有幾十年的歷史，積累了大量的運行經驗，但在污水處理廠運行過程中仍然時常出現不明原因的除磷效果惡化的現象，甚至不得不借助于化學除磷。產生這些問題的根本原因是由于對生物除磷過程主要功能微生物——聚磷菌的代謝活性和種群結構缺少清楚的認識和理解，從而無法建立有效的調控措施。污水生物處理系統內除磷微生物學研究是污水生物除磷最基本、最重要的內容，是生物除磷系統高效穩定運行的保障。

大量研究已經證明，無論是實驗室規模還是生產規模的生物除磷系統中，聚磷菌都是占主導地位的除磷微生物。但是由于聚磷菌種群的復雜性和多樣性，不同污水處理系統中的聚磷菌對環境的動態響應結果差異很大，因此只有對這一復雜菌群的菌群結構進行細化分類與精確定量，才能清楚的認識其細菌種類和密度隨環境的變化情況、才能認識菌群的穩定性特征、才能明確聚磷菌在磷元素降解過程中的作用，對提高污水處理系統除磷效果具有重要意義。由于無法實現純培養，因此不依賴于純培養的分子生物學分析方法成為聚磷菌研究的主要手段。目前，研究者主要借助于熒光原位雜交（FISH）、限制性末端片段長度多態性分析（T-RFLP）、PCR-基因測序等方法識別并定量分析活性污泥樣品中的聚磷菌。上述方法多數采用16S?rRNA作為基因標記物，但由于16S?rRNA的高度保守性使其無法區分聚磷菌的各進化分支，因此上述方法都無法實現對聚磷菌不同進化分支的區分與定量。與相對保守的16S?rRNA相比，功能基因具有更多的序列變化，利用功能基因可以區分生態功能不同但親緣相近的微生物種群。聚合磷酸鹽激酶是聚磷菌細胞內催化合成聚合磷酸鹽的關鍵酶，直接影響聚磷菌的除磷效果。由于聚合磷酸鹽激酶基因的高系統分辨率和清晰的樹結構，因此在揭示聚磷菌種群結構上，較16S?RNA是更好的遺傳標記。因此本專利采用編碼聚合磷酸鹽激酶的功能基因作為遺傳標記解析污水處理系統中聚磷菌的代謝活性和菌群結構，從微觀角度揭示聚磷菌各進化枝對環境條件的動態響應，為污水生物除磷系統的穩定運行奠定微生物學理論基礎。

實時熒光定量PCR技術作為一種核酸定量的手段，以其高靈敏性、高特異性、高精確度、實時性、污染少等優點，在微生物生態學中逐漸得到廣泛的應用。以聚合磷酸鹽激酶基因作為標記物的實時熒光定量PCR，使我們不僅可以定性，也可以定量研究污水處理系統中聚磷菌的不同進化分支的結構組成及數量變化，從而深入探索聚磷菌群落與環境因子之間的相互作用及其動態變化過程。

本發明采用實時熒光定量PCR技術對污水處理廠中的聚磷菌進行定量檢測。本發明在技術上不同于現有技術，主要體現在以下三方面：

（1）標準品DNA的來源。目前聚磷菌無法實現純培養，因此標準品只能來自聚磷菌的富集培養系統，從富集聚磷菌的活性污泥中提取DNA作為標準品來源。但是目前對聚磷菌的富集，主要集中在人工配水系統，由于人工配水的碳源主要選擇乙酸或丙酸，使聚磷菌的種群單一，以ⅡA分支為主，其次為I分支，并導致后基因組學研究也主要集中在ⅡA和I分支。這樣就無法實現獲得聚磷菌所有分支或主要分支的標準品。本專利采用的標準品全部來源于處理實際生活污水的反應器，運行過程中，工藝條件和廢水成分都接近實際生產情況，并且反應器取得了良好的除磷效果，出水磷濃度優于《城鎮污水處理廠污染物排放標準》（GB18918-2002）規定的一級A排放標準。由于富集系統運行條件和廢水成分的復雜性，使得聚磷菌菌群分支豐富，獲得了主要的5個進化分支的標準品，分別為I、ⅡA-D。