[發明專利]污水處理廠聚磷菌實時熒光定量PCR檢測方法

有效

• 申請號: 201310042881.9
• 申請日: 2013-02-03
• 公開（公告）號: CN103146814A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 曾薇;李博曉;張立東;王向東;彭永臻
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

1.一種污水處理廠聚磷菌實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于：提取實際生活污水富集的聚磷菌的基因組DNA，采用聚磷菌5個分支的聚合磷酸鹽激酶基因引物，先采用溫度梯度PCR后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定不同進化分支的復性溫度；再采用常規PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢驗后，切膠純化回收DNA擴增片段，獲得I、ⅡA、ⅡB、ⅡC和ⅡD5個分支的擴增片段；將5個分支的擴增片段與載體連接，連接好的載體導入感受態細胞培養12-16h，挑取白斑進行重組菌落PCR驗證；提取包含目的片段的質粒用作實時熒光定量PCR的標準品，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，建立標準曲線；利用建立的標準曲線對污水處理廠中聚磷菌進行定量檢測；

上述溫度梯度PCR和常規PCR擴增體系及反應條件如下：

常規PCR擴增程序如下：95℃變性10min；25-35個循環反應，每個循環包括95℃40s，A℃1min，72℃2min；最后72℃延伸5min；其中復性溫度A由梯度PCR確定，不同分支的最佳復性溫度如下：

聚磷菌分支????????I分支??????ⅡA分支??????ⅡB分支??????ⅡC分支?????IID分支

最佳復性溫度A?????61℃???????58℃?????????61℃?????????66℃????????63℃

上述瓊脂糖凝膠電泳的瓊脂糖質量百分比濃度為2%，電泳電壓為120V，電泳時間為60min；

上述實時熒光定量PCR擴增反應體系及反應條件為：

聚磷菌分支Ⅰ、ⅡA、ⅡB和ⅡC的實時熒光定量PCR反應采用三步法，在復性和延伸階段檢測和報告熒光，擴增程序如下：95℃變性3min；30-55個循環反應，每個循環包括94℃?30s，A℃?45s；最后72℃延伸30s；復性溫度A℃與常規PCR復性溫度相同；分支IID的實時熒光定量PCR反應采用四步法，擴增程序如下：95℃變性3min；30-55個循環反應，每個循環包括94℃?30s，63℃?45s，72℃?30s，84℃5s；其中熒光信號檢測溫度為84℃。