[發(fā)明專利]一種修飾的山羊防御素基因及制備方法和應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310042508.3
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103103196A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發(fā)明（設計）人: 劉桂瓊;姜勛平;劉勝敏;康建鋒
• 申請（專利權）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47;A61K38/17;A61P31/04;A23B4/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，具體涉及一種修飾的山羊防御素基因，還涉及一種修飾的山羊防御素，還涉及一種修飾的山羊防御素的制備方法，還涉及一種修飾的山羊防御素在抑制細菌生長上的應用。

背景技術

防御素是廣泛存在于動物、植物和昆蟲等生物體中的小肽，目前已經(jīng)分離鑒定的生物防御素已經(jīng)超過100種。防御素是一類小的陽離子抗菌肽，大約由21～45個氨基酸殘基組成，分子量為3～6kD。大多數(shù)防御素分子內(nèi)含有6～8個保守的半胱氨酸殘基，形成三對或四對分子內(nèi)二硫鍵，并通過分子內(nèi)二硫鍵形成一個β-折疊片狀結(jié)構。富含精氨酸，分子在中性溶液中帶正電荷，具有高效、廣譜抗菌活性，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌（念珠菌屬、隱球菌屬、曲霉）、被膜病毒（艾滋病病毒）等具有一定的殺滅效果，并且不會使微生物產(chǎn)生耐藥性，對正常動物的細胞表現(xiàn)出非特異性的細胞毒害作用。

山羊生殖道系統(tǒng)疾病對山羊生產(chǎn)具有較大的危害，目前普遍采用抗生素進行治療。由于大量使用抗生素，在山羊機體內(nèi)可能產(chǎn)生耐藥菌株而使治療失敗；同時，大量抗生素還可能對羊肉、羊奶等羊產(chǎn)品造成污染而影響食品安全。防御素是小分子肽類，具有廣譜抗菌活性，由于其特殊的抗菌機制，機體對其不產(chǎn)生耐藥性，可以解決細菌耐藥性問題，是新一代抗菌素。

天然防御素在動植物體中含量很少，提取分離的成本費用也很高，這就制約了防御素工業(yè)化生產(chǎn)和在畜禽疾病中的應用，因此通過基因工程的方法大量生產(chǎn)防御素，獲得足夠的、有活性的防御素成了研究熱點。

目前許多實驗通過基因工程的方法，成功地將防御素基因?qū)氲礁鞣N生物體中并得到良好表達，比如人類防御素、豬防御素、牛防御素等都是將防御素基因?qū)氲秸婧吮磉_載體中并得到表達并申請專利，表達出的防御素具有較好的生物學活性。目前尚未有對山羊防御素進行基因工程方法大量制備的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是在于提供了一種修飾的山羊防御素基因，根據(jù)防御素序列（GenBank:DQ532360.1），針對畢赤酵母密碼子偏好性對其進行修飾，獲得了一種優(yōu)化了的山羊防御素基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。

本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種修飾的山羊防御素，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2所示，其活性優(yōu)于天然防御素，成本低廉，價格實惠，性價比高。可替代傳統(tǒng)的抗生素及一些化學性的防腐劑，對食品安全及臨床治療具有重要的意義。

本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種修飾的山羊防御素的制備方法，方法簡單，易行，適于大規(guī)模生產(chǎn)。

本發(fā)明最后一個目的是提供了一種修飾的山羊防御素在抑制細菌生長上的應用，通過對鮮肉進行防御素蛋白液的處理，極大的提高了肉類的保鮮時間。溫度越低保鮮時間越長。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：

1.修飾的山羊防御素基因的獲得:

根據(jù)山羊防御素基因（GenBank:DQ532360.1），針對畢赤酵母密碼子偏好性對其進行修飾，獲得了一種優(yōu)化了的山羊防御素基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。設計含有部分互補序列的引物，在引物兩端設計EcoRⅠ和NotⅠ兩個限制性內(nèi)酶切位點，通過重疊PCR的方法擴增得到完整的經(jīng)過修飾的GBD-1基因。

設計的引物序列如下：

①：ACTGAATTCATGAGTCGTCGAAGCTGCCATAGGAATAAAGGCGTCTGTGCT

②：CTGTCTCATGTTTCTAGGGCATCTGGTCAGAGCACAGACGCCTTT

③：AACTGGGGGACCGAAACAGGTGCCAATCTGTCTCATGTTTCT

④：CAGGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTAACTGGGGGACCGAA

2.重組表達質(zhì)粒的構建與鑒定：

將測序正確的目的片段和pPICZαA表達載體分別用EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，酶切之后用T₄?DNA連接酶進行連接，構建重組表達質(zhì)粒pPICZαA/GBD-1。將重組表達質(zhì)粒在含有Zeocin的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)、篩選，用小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，進行雙酶切，并將重組表達質(zhì)粒pPICZαA/GBD-1送上海生工測序，測序正確的，為本發(fā)明的重組表達質(zhì)粒pPICZαA/GBD-1。

3.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化：