[發明專利]一種修飾的山羊防御素基因及制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310042508.3
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103103196A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 劉桂瓊;姜勛平;劉勝敏;康建鋒
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/81;C07K14/47;A61K38/17;A61P31/04;A23B4/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種人工合成的修飾的山羊防御素基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。

2.一種修飾的山羊防御素，其序列為SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

3.權利要求2所述的一種修飾的山羊防御素的制備方法，其步驟是：

1）GBD-1基因的PCR擴增：引物1、2、3互為模板和引物進行PCR，反應體系為：引物1、2、3分別加入2?μL、1?μL、2?μL，2.5?mM?dNTPs?3.5?μL，10×EasyTaq?Buffer?5?μL，EasyTaq?DNA?Polymerase?1?μL，補無菌雙蒸水至50?μL；

擴增條件：94?℃預變性?4?min；94?℃?30?s，62?℃?30?s，72?℃?30?s，32個循環；72℃充分延伸10?min；

PCR產物經2?%質量體積比的瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠純化回收試劑盒回收目的片段，編號為1-2-3；

引物1、1-2-3、4再互為模板和引物進行PCR，反應體系為：引物1、1-2-3、4分別加入2?μL、1?μL、2?μL，2.5?mM?dNTPs?3.5?μL，10×EasyTaq?Buffer?5?μL，EasyTaq?DNA?Polymerase?1?μL，補無菌雙蒸水至50?μL；

擴增條件：94?℃預變性?4?min；94?℃?30?s，62?℃?30?s，72?℃?30?s，32個循環；72?℃充分延伸10?min；

PCR產物經2.0?%質量體積比的瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA凝膠純化回收試劑盒回收目的片段，該目的片段即為修飾的山羊防御素目的序列；

所述的引物為：

1：ACTGAATTCATGAGTCGTCGAAGCTGCCATAGGAATAAAGGCGTCTGTGCT

2：CTGTCTCATGTTTCTAGGGCATCTGGTCAGAGCACAGACGCCTTT

3：AACTGGGGGACCGAAACAGGTGCCAATCTGTCTCATGTTTCT

4：CAGGCGGCCGCCTTCTTTCTGCAGCATTTAACTGGGGGACCGAA；

2）重組表達質粒的構建與鑒定:

將測序正確的目的片段和pPICZαA表達載體分別用EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，酶切之后用T_4?DNA連接酶進行連接，構建重組表達質粒pPICZαA/GBD-1；將重組表達質粒在含有Zeocin的LB培養基中培養、篩選，用小量提取試劑盒提取質粒，進行雙酶切，并將重組表達質粒pPICZαA/GBD-1測序，測序正確的，為重組表達質粒pPICZαA/GBD-1；

3）?重組質粒的轉化:

將鑒定好的重組表達質粒pPICZαA/GBD-1用SacⅠ線性化，轉化感受態畢赤酵母中，利用電轉儀進行電轉，同時轉化pPICZαA空載體作為對照；電轉后涂布于含有Zeocin的YPD平板中，30℃培養至有單菌落出現，將單菌落接種到含有Zeocin的YPD液體培養基中進一步培養，取部分菌落，提取酵母基因組DNA，并利用載體特異引物5’AOX和3’AOX進行PCR鑒定，并測序；

5’AOX：GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3’AOX：GCAAATGGCATTCTGACATCC；

4）?重組酵母的誘導表達:

將步驟3）中獲得的陽性重組質粒接種到BMGY培養液中活化15h，離心，去上清，沉淀用BMMY培養液懸浮后誘導，每24h加甲醇至終濃度為1%，84h后1ml菌液兩管，離心留上清，-20℃保存。

4.權利要求2所述的山羊防御素在抑制大腸桿菌生長上的應用。

5.權利要求2所述的山羊防御素在抑制金黃色葡萄球菌生長上的應用。

6.權利要求2所述的山羊防御素在抑制肺炎鏈球菌生長上的應用。

7.權利要求2所述的山羊防御素在豬肉保鮮上的應用。