[發(fā)明專利]鬼針草離體再生體系建立的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310041916.7
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103053428A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設計）人: 崔波;李長看;蔣素華;田云芳;王默霏;馬杰
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州師范學院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 張曉萍

技術(shù)領域

本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術(shù)領域，特別涉及鬼針草離體再生體系建立的方法。

背景技術(shù)

鬼針草（Bidens?bipinnata?L.）為菊科鬼針草屬一年生草本植物，全國大部分地區(qū)均有分布。莖略呈方形或圓柱形，幼莖有稀疏短柔毛，尤以節(jié)處為多。葉紙質(zhì)，黃綠色，易碎，多皺縮或破碎，常脫落，展平后，完整葉2回羽狀深裂，裂片披針形，上面無毛，下面主脈有稀疏毛。莖頂常有扁平盤狀花托，著生10余枚針束狀、有四棱的果實，偶見黃色的頭狀花序。鬼針草全草入藥，有清熱解毒、散瘀活血的功效，主治上呼吸道感染、咽喉腫痛、急性闌尾炎、急性黃疸型肝炎、胃腸炎、急性腎炎、風濕關(guān)節(jié)疼痛、瘧疾等疾，外用治瘡癤、毒蛇咬傷及跌打腫痛等癥，民間亦應用鬼針草治療高血壓、糖尿病等病癥，效果不錯。鬼針草是一種很好的、傳統(tǒng)的常用中藥材，但是，由于鬼針草通常以種子繁殖，存在著繁殖率低、品質(zhì)易退化、藥用成分含量低且不穩(wěn)定等問題，影響了其工業(yè)化、標準化的加工利用，建立一種快速、高效的鬼針草離體再生方法，可獲得性狀一致的全草，解決上述問題，保證鬼針草的品性統(tǒng)一和有效地應用，同時還可為進一步改良其性狀而進行的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎，但迄今為止，還未見有關(guān)于鬼針草組織培養(yǎng)和離體再生體系建立技術(shù)的報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于發(fā)明一種鬼針草離體再生體系建立的方法。

本發(fā)明的鬼針草離體再生體系建立的方法由無菌材料培養(yǎng)體系、不定芽誘導培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根苗培養(yǎng)和練苗移栽構(gòu)成,技術(shù)分五個階段：1、無菌材料的獲得：取鬼針草種子經(jīng)MS培養(yǎng)基培養(yǎng)得到無菌苗；2、不定芽培養(yǎng)：由無菌苗外植體—下胚軸和子葉經(jīng)誘導培養(yǎng)生成不定芽，誘導培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.1～3.0mg/l+KT0.1～3.0mg/l+NAA0.1mg/l+3%蔗糖+0.9%瓊脂；3、繼代增殖培養(yǎng)：將不定芽切分進行繼代增殖培養(yǎng)分化得到叢生芽，增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.1～3.0mg/l+KT0.1～3.0mg/l+NAA0.1mg/l+3%蔗糖+瓊脂0.9%；4、生根苗培養(yǎng)：將叢生芽分株經(jīng)生根培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得生根苗,形成完整植株，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA?0.1～0.5mg/l+3%蔗糖+0.9%瓊脂；5、練苗移栽：將生根苗經(jīng)煉苗后由培養(yǎng)基移栽到土壤中。

本發(fā)明由以下步驟實現(xiàn)：

1.無菌材料的獲得：將鬼針草的果實置于75％乙醇中浸泡15s滅菌，取出，用無菌水沖洗3-5次，加入0.1％氯化高汞滅菌，時間控制為8min，再用無菌水沖洗4-5次，用無菌濾紙吸干水分，刨開果實取出種子接種于MS固體培養(yǎng)基上，接種后放入光照培養(yǎng)箱，整個操作在超凈工作臺進行，培養(yǎng)條件為溫度23±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000～3000Lux，夜間保持黑暗，13～15d獲得具真葉的無菌材料—無菌苗。

2.不定芽誘導培養(yǎng)：取無菌苗的外植體—子葉和下胚軸，子葉切成0.5cm²大小，葉背向下置于誘導培養(yǎng)基，下胚軸切成0.3～0.5cm長短，平放于誘導培養(yǎng)基，誘導培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BA0.1～3.0?mg/l?+?KT0.1～3.0mg/l+NAA0.1mg/l+3%蔗糖+0.9%瓊脂，pH5.8～6.0，培養(yǎng)條件為溫度23±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000～3000Lux，夜間保持黑暗，5d形成淡黃綠色愈傷，繼續(xù)培養(yǎng)13～18d，分化出不定芽，子葉誘導率90%～95%，下胚軸誘導率達100%。

3.繼代增殖培養(yǎng)：將不定芽切分，接種至增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+6-BA?0.1～3.0mg/l?+?KT?0.1～3.0mg/l?+?NAA?0.1mg/l+?3%蔗糖+瓊脂0.9%，pH5.8～6.0，培養(yǎng)條件為溫度23±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000～3000Lux，夜間保持黑暗，10～18d分化出叢生芽，芽增殖倍數(shù)為3～6倍。

4.生根苗培養(yǎng)：形成的叢生芽長至約2～3cm時，將其分成單株置于培養(yǎng)瓶內(nèi)進行生根培養(yǎng)，所用生根培養(yǎng)基為1/2MS?+IBA?0.1～0.5mg/l+3%蔗糖+?0.9%瓊脂，pH5.8～6.0，培養(yǎng)條件為溫度23±2℃，光照時間12h/d，光照強度2000～3000Lux，夜間保持黑暗，7～10d分化出5～8條不定根，得到生根苗，形成完整植株，生根率100%。