[發(fā)明專利]人靜脈注射免疫球蛋白中活化凝血因子Ⅺ檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310041747.7
• 申請日: 2013-02-04
• 公開（公告）號: CN103185710A
• 公開（公告）日: 2013-07-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馬莉;孫盼;李長清;袁靖;陳云華;劉欣晏;楊剛
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州泰邦生物制品有限公司;中國醫(yī)學科學院輸血研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 貴陽中工知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 52106
• 代理人: 陳忠俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種人靜脈注射免疫球蛋白（pH4,Human?intravenous?immunoglobulin，以下簡稱IVIG）中活化凝血因子Ⅺ（Activated?coagulation?factor?XI，以下簡稱FXIa）的檢測方法。該法可以精確的檢測出IVIG中FXIa的具體含量，靈敏度可達0.12?nmol/L。?

背景技術(shù)

IVIG是由乙型肝炎疫苗免疫的健康人血漿經(jīng)低溫乙醇蛋白分離法提取的免疫球蛋白組分，經(jīng)深加工和病毒滅活等步驟精制而成。IVIG具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的雙重治療作用，臨床使用廣泛。近年來隨著IVIG臨床使用數(shù)量的增加，該制品輸注人體后產(chǎn)生的不良反應(yīng)事件也逐漸增加，危害嚴重。研究表明，此類血液制品中殘存的微量凝血激活物—FXIa是導致患者發(fā)生血栓的主要誘因。目前國際尚未出臺關(guān)于IVIG致栓性的強制檢測規(guī)定。?

目前《中國藥典》2010年版?三部附錄IX?O規(guī)定，非活化的部分凝血活酶時間（Non-activated?partial?thromboplastin?time,以下簡稱NAPTT法）可用于定性檢測血液制品（如凝血因子濃縮物）中有無活化凝血因子。其檢測原理是將待檢測樣本加入到枸櫞酸抗凝的正常人血漿中，再加入一定濃度的磷脂、Ca²⁺后測定樣品凝塊形成時間。目前該方法存在以下不足：①僅能定性，無法實時監(jiān)測樣品中凝血酶生成過程的變化；②僅能通過樣品凝固時間判定結(jié)果，人為因素影響較大，無法準確測定樣品中活化凝血因子的具體含量。?

傳統(tǒng)NAPTT法的操作步驟為：（1）制備缺血小板人血漿（Platelet-poor?plasma,以下簡稱PPP）：無菌采集人全血于3.8%枸櫞酸鈉抗凝劑（9：1）中，混勻，以1500轉(zhuǎn)/分鐘，?4℃離心30min。用塑料注射器取上層2/3血漿，以3500轉(zhuǎn)/分鐘，4℃離心30min，取上層2/3血漿，分裝于塑料管中，每支3ml，保存-40℃?zhèn)溆茫唬?）將PPP與腦磷脂懸液混合，37℃放置1分鐘，加經(jīng)稀釋的供試品溶液0.1ml，然后加入已預熱至37℃的0.025mol/L氯化鈣溶液0.1ml，記錄凝固時間。同時做空白對照。結(jié)果判定：空白對照凝固時間不低于200s，實驗成立。1：10和1：100供試品稀釋液凝固時間應(yīng)不低于150s。?

基于上述因素，本發(fā)明通過優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立基于凝血酶生成試驗（Thrombin?generation?test,以下簡稱TGT）法檢測IVIG中FⅪa的新方法，該方法具有良好的重復性，可準確定量檢測樣品中FⅪa的含量，進一步減少了人為誤差，有效確保了試驗結(jié)果的真實性和可靠性。?

??

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有檢測技術(shù)所存在的上述不足，建立一種準確度好、靈敏度高的基于TGT法檢測IVIG中FXIa的方法，該方法適用于IVIG制品中微量FXIa的檢測。?

本發(fā)明的操作步驟與NAPTT法不一致，其技術(shù)解決方案為：?

（1）枸櫞酸鈉抗凝血漿中加入玉米胰蛋白酶抑制物，可特異、有效地避免因在采血過程中凝血因子Ⅺ的預活化，從而得到不含F(xiàn)Ⅺa的血漿，從而分離制備出不含F(xiàn)Ⅺa的PPP；

(2）反應(yīng)體系中加入凝血酶特異性熒光底物，特異的凝血酶熒光底物以及磷脂劑濃度的確定：凝血酶特異性熒光底物選擇B-VA-AMC,對不同濃度底物進行篩選，其中底物工作濃度為1~7mmol/L；磷脂劑選則腦磷脂，選擇工作濃度為1~3.5μmol/L；利用分光光度計連接計算機對凝血過程進行掃描，通過熒光信號強弱，可間接反映凝血酶生成含量變化，最后繪制動力學曲線；

（3）不同含量的FⅪa標準品或IVIG樣本中加入含磷脂劑的凝血酶熒光底物以及鈣離子源啟動凝血酶生成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)果通過熒光分光光度計監(jiān)測凝血酶生成過程中熒光值的變化，最后使用GraphPad軟件處理數(shù)據(jù)得到凝血酶生成曲線，將受檢樣品的凝血酶生成濃度達到峰值所需的時間（Peak?time?of?thrombin，以下簡稱TTP）與FⅪa標準品的TTP進行比較，可以間接獲得受檢樣品中FⅪa的水平。