[發明專利]植物質膜蛋白再溶解的方法及其在雙向熒光差異凝膠電泳中的應用

無效

• 申請號: 201310041325.X
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103130866A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 李銀心;聶玲玲;陳顯揚;郭杰;范鵬祥
• 申請（專利權）人: 中國科學院植物研究所
• 主分類號: C07K1/02
• 分類號: C07K1/02;C07K1/30;G01N27/447
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢

技術領域

本發明涉及一種植物質膜蛋白再溶解的方法及其在雙向熒光差異凝膠電泳中的應用。

背景技術

植物細胞質膜是細胞與外界環境的屏障，也是植物細胞進行物質交換、能量轉換及信息傳遞等重要生命活動的關鍵部位，在水分、無機離子、有機小分子跨膜運輸，感受及傳遞脅迫信號等過程中發揮著重要作用。質膜功能的主要執行者是質膜蛋白，然而植物質膜蛋白豐度低，疏水性強，且大部分質膜蛋白存在糖基化、磷酸化等翻譯后修飾，造成膜蛋白的微觀不均一性，因此如何分離純化和鑒定細胞膜蛋白，是植物質膜研究的難點。

植物細胞質膜蛋白的分離鑒定主要包括基于凝膠（gel-based）的方法和不基于凝膠（gel-free）的方法，大多數質膜蛋白的研究采用不基于凝膠的方法，如基于鳥槍法及1-DE-LC-MS/MS的膜蛋白分離鑒定或定量方法，這種方法自動化程度高、通量高、能夠對疏水性較強的膜蛋白成功鑒定，但結果的重復性差、成本較高、數據的復雜度更高，且高豐度蛋白干涉了低豐度蛋白的鑒定，給研究帶來了較多的困難。盡管有報道指出基于凝膠的雙向電泳技術不適合鑒定豐度較低、疏水性強的質膜蛋白，但這種方法具有高通量、直觀等特點，是當前僅有的可以同時分離大量復雜的蛋白質混合物的關鍵技術。有科學家通過比較不基于凝膠的方法與基于凝膠的方法在大豆葉片質膜蛋白研究中的優劣，發現gel-free的實驗結果并不能完全替代gel-based的實驗結果，這兩種實驗技術之間是很好的互補。

目前，已有一些采用雙向電泳技術對植物質膜蛋白進行分析的實驗，但存在著較多問題：植物質膜蛋白的提取效率低，而雙向電泳技術需要的蛋白量較大；質膜蛋白疏水性較強，難溶解，難溶的質膜蛋白較難進入膠內，影響了后期的分離鑒定。Komatsu等人采用TCA/丙酮的方法沉淀了大豆葉片的質膜蛋白，并對其進行雙向電泳分析，但其電泳結果不是很理想，橫向拖尾較為嚴重。Huang等人通過添加質膜蛋白的增溶劑以溶解更多的質膜蛋白，但其電泳結果同樣橫向拖尾較為嚴重，分辨率較低。因此，提高質膜蛋白提取效率，優化質膜蛋白再溶解方法是植物質膜蛋白組學研究的難點。

近年來，新的熒光標記技術相繼應用于雙向電泳的研究中。2-D?DIGE(two-dimensional?differential?gel?electrophoresis，雙向熒光差異凝膠電泳)是一種新出現的熒光標記定量蛋白質組學技術，它比經典的雙向電泳技術具有更高的動力學范圍和靈敏性，鑒定的靈敏度已達pg級，能夠有效的鑒定低豐度的膜蛋白，且實驗中只需50μg的蛋白，節省了雙向電泳過程中質膜蛋白的用量，此技術的出現大大推進了基于凝膠的質膜蛋白組學研究。目前，適用于此技術的植物質膜蛋白提取及再溶解方法尚未報道，因此，非常有必要建立一種適用于2-D?DIGE技術的植物質膜蛋白提取及再溶解方法。

植物質膜蛋白的研究多集中在甜土植物（如水稻、大豆等模式植物）中，而鹽生植物是植物中的重要類群，質膜在其鹽適應過程中發揮著重要作用，但是關于鹽生植物質膜蛋白的研究較少。因此，建立一套既適用于甜土植物又適用于鹽生植物的植物質膜蛋白提取及分離方法，為今后開展植物質膜蛋白的研究奠定基礎是非常有必要的。

發明內容

本發明的目的是提供一種植物質膜蛋白再溶解的方法及其在雙向熒光差異凝膠電泳中的應用。

本發明提供的植物質膜蛋白再溶解的方法，包括如下步驟：將植物質膜蛋白加入裂解液中，在冰浴中超聲處理，然后渦混使所述植物質膜蛋白溶解，最后離心收集上清液，即為質膜蛋白溶液；

所述裂解液是在DIGE裂解緩沖液中加入N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷得到的，所述N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷在所述裂解液中的濃度為0.5-2g/100mL（如0.5-1g/100mL、1-2g/100mL、0.5g/100mL或2g/100mL）。所述N-十二烷基-β-D-麥芽糖苷在所述裂解液中的濃度具體可為1g/100mL。

所述超聲處理的參數具體可為：超聲功率200W，處理時間30s，每工作3s停10s。

所述渦混的時間具體可為3h以上（如3h）。

所述離心的參數具體可為：室溫、20000g離心30min。

所述DIGE裂解緩沖液由溶質和溶劑組成，所述溶劑為25mM?Tris-HCl緩沖液（pH8.8)，所述溶質及其在DIGE裂解緩沖液中的濃度如下：7M尿素、2M硫脲和4g/100mL?CHAPS（3-(3-(膽酰氨基丙基)二甲氨基)丙磺酸）。