[發明專利]旋毛蟲肌幼蟲ES抗原基因疫苗及其制備方法

有效

• 申請號: 201310040669.9
• 申請日: 2013-02-03
• 公開（公告）號: CN103352047A
• 公開（公告）日: 2013-10-16
• 發明（設計）人: 楊桂連;王春鳳;楊文濤;劉高升;趙葛
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/12;A61K48/00;A61P33/00
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬于生物技術領域，旋毛蟲肌幼蟲ES抗原基因疫苗及其制備方法。

背景技術

旋毛蟲寄生于人以及多種脊椎動物體內，是引起旋毛蟲病的人獸共患寄生蟲病。旋毛蟲可寄生于人及150多種動物體內，感染的主要原因是由于機體攝入生的或者不熟的帶有旋毛蟲肌幼蟲包囊的肉制品而導致，若不及時診斷和治療，可致患者死亡。據估計，目前全世界大約有1100萬感染者，我國1975年后，在吉林、遼寧、黑龍江、河南、湖北等省市區也有本病暴發的報告。本病不僅嚴重危害人類健康，還可對養豬業及肉類出口造成巨大的經濟損失，國際獸醫局1998年報道了1萬頭生豬感染，我國26個省市區均有豬旋毛蟲病的流行，在我國廣大農村地區的集貿市場上常有私自屠宰后未經旋毛蟲檢疫的豬肉或豬肉制品出售，給人類健康和動物健康養殖帶來了極大的潛在威脅。然而，目前并無有效的旋毛蟲疫苗。

旋毛蟲的發育階段為成蟲期、新生幼蟲期和肌幼蟲期三個階段，蟲體抗原成分多樣，主要為表面抗原、蟲體抗原、排泄-分泌抗原（ES抗原）、桿細胞顆粒相關抗原。研究表明旋毛蟲ES抗原在三個時期均可以產生，是旋毛蟲代謝分泌的直接暴露于宿主的免疫系統中，是宿主抗旋毛蟲感染的最主要的保護性抗原，也是當前研究最為主要的旋毛蟲抗原。

旋毛蟲ES抗原是其天然孔分泌或者是排泄的抗原物質，不同時期的蟲體都能產生此抗原物質，主要的分泌部位是蟲體食道管附近的桿狀細胞分泌。ES抗原是有多種蛋白成分組成，Despommier等用SDS-PAGE發現旋毛蟲ES抗原中有28種抗原成分，用IEF法可發現37種抗原成分，其中糖蛋白為22種；國內學者朱興全等也通過實驗研究分析證實旋毛蟲肌幼蟲ES抗原的組成分非常復雜。研究發現，43ku和45ku?ES?抗原能夠誘導機體產生主要的保護性抗體。

旋毛蟲43ku抗原是ES抗原的主要蛋白組分，在旋毛蟲屬內具有高度的保守性。研究表明43ku?ES抗原與宿主的營養、細胞形成、排蟲反應及保護性免疫應答有關,而且43ku?ES?抗原糖蛋白已被作為免疫診斷和研制疫苗的良好候選抗原。

旋毛蟲45?ku?抗原是一種分泌性糖蛋白,?也是旋毛蟲肌幼蟲ES?產物的主要抗原成分之一。Arasu等首先克隆了?45?ku抗原基因，其重組蛋白可以被旋毛蟲感染小鼠血清識別。旋毛蟲45?ku抗原推測是絲氨酸蛋白酶一個多基因家族，編碼肌幼蟲的一種蛋白，但卻去除了酶的活行中心。研究還發現該抗原不僅具有良好的免疫原性，而且對于旋毛蟲攻擊感染具有較強的免疫保護性。最新研究表明，此基因在旋毛蟲肌幼蟲和成蟲中都有表達，旋毛蟲45?ku抗原包括肽表位和糖表位，不僅具有可形成包囊旋毛蟲種所共有的抗原表位，而且具有旋毛蟲種特異的抗原表位能夠被單抗識別，王中全等人應用RT-PCR方法對旋毛蟲45?ku抗原基因進行克隆與表達，在所擴增的890個堿基中有與美國學者報道的基因序列同源性達99.6%，這表明45ku抗原蛋白基因存在高度的保守性，是DNA疫苗研制的良好的候選基因。

DNA疫苗是指將編碼某種抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。該疫苗既具有減毒疫苗的優點，同時又無逆轉的危險，因此越來越受到人們的重視，被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之后的第三代疫苗。

發明內容

本發明的目的是提供一種有效預防旋毛蟲感染、提高減蟲率的聯合重組DNA疫苗及其制備方法。

旋毛蟲肌幼蟲重組43ku?ES抗原基因的真核表達載體pVAXⅠ-43ku，它是在真核表達載體pVAXⅠ中插入了43ku基因，所述的43ku其堿基序列如序列表SEQID?No.1所示；

旋毛蟲肌幼蟲重組45ku?ES抗原基因的真核表達載體pVAXⅠ-45ku，它是在真核表達載體pVAXⅠ中插入了45ku基因，所述的45ku其堿基序列如序列表SEQID?No.2所示；

旋毛蟲肌幼蟲ES抗原基因疫苗，它包括：由重組質粒pVAXⅠ-43ku和pVAXⅠ-45ku；

它們的重量比為1∶1；

所述的pVAXⅠ-43ku和pVAXⅠ-45ku的濃度均為1μg/μL。

旋毛蟲肌幼蟲ES抗原基因疫苗制備方法，包括：

（1）制備旋毛蟲肌幼蟲總RNA，反轉錄為cDNA，并以cDNA為模板，用引物：