[發明專利]耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法

有效

• 申請號: 201310040316.9
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103081807A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李紀元;范正琪;李辛雷;殷恒福;吳斌
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

技術領域

????本發明屬于生物技術領域，具體為耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法。

背景技術

耐冬山茶為第三紀的殘遺植物種類，因地殼運動，使得青島耐冬與外界山茶基因交流甚少，從而保留了古老而獨具特色的遺傳特性。從觀賞角度而言，耐冬山茶花色艷麗，花型優美，為青島市花；同時，其葉莖花亦可入藥，用于預防和治療多種疾病，極具醫療應用前景；不僅如此，耐冬山茶還具有很強的CO₂吸收能力，且對H₂S等有害氣體具有較強的抗性，故亦具有凈化空氣等環保作用，可謂全身是寶。

目前生產上使用的種苗仍是以傳統方式培育為主。然而，山茶的生長速度慢，繁殖系數低，靠嫁接、扦插等傳統方式培育，完全不能滿足市場的需求。而關于山茶屬植物的組織培養，國內從20世紀80年代開始就有諸多研究工作，并取得了可喜的進展。采用山茶種子的子葉、幼齡山茶花的莖尖與帶芽莖節、成年山茶花的莖尖與帶芽莖節等，作為外植體均可獲得再生植物。現階段通過“芽生芽”這種莖段培養的方式得到耐冬山茶的例子已有，而對于耐冬山茶由愈傷組織誘導到不定芽分化的例子卻鮮有報道，也未見專利申請。

發明內容

針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在于設計提供一種耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法的技術方案，采用該方法繁殖系數較高，周期較短，同時也為山茶分子育種奠定基礎。

所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，瀝干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用；

2）再次使用75％酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1％HgCl₂浸泡6-10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用；

3）剝去種子的內外種皮，接種于愈傷誘導培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-12,4-D?和?1.8-2.2?mg?L^-1?6-BA，愈傷誘導培養基中蔗糖含量為2-4%，瓊脂0.6-0.8%，滅菌前將PH調至5.7-5.9，120-125℃下滅菌20-25分鐘；

4）材料接入愈傷誘導培養基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時候誘導出的細密的愈傷組織已經在材料與培養基接觸的外圍長滿了厚實的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時再將長有愈傷組織的材料轉移至愈傷組織過渡培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.1-0.15?mg?L^-1NAA?+?2.0-2.2?mg?L^-16-BA；

5）材料在愈傷組織過渡培養基內進行培養，待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶一點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-1NAA?+?9-11?mg?L^-1?6-BA或者MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-1IBA?+?9-11?mg?L^-16-BA；

6）材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mg?L^-1的IBA浸沒處理20-25min，然后轉到MV液體培養基的紙橋上在100-200?μmol?m^-2?s^-1下誘導生根；誘導生根階段，采用MV液體培養基加入蔗糖15-20?g?L^-1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養一段時間之后，幼根伸長并逐漸木質化。

所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟1）中：第一次消毒清洗時間9-10秒。