[發明專利]耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法

有效

• 申請號: 201310040316.9
• 申請日: 2013-02-01
• 公開（公告）號: CN103081807A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 李紀元;范正琪;李辛雷;殷恒福;吳斌
• 申請（專利權）人: 中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.?耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）采集9月初的耐冬山茶果實，剝去果皮，用洗滌劑搓洗種子，再用自來水搓洗至無泡沫，置于培養瓶中，加入75%酒精進行第一次消毒清洗8-12秒，然后純凈水清洗2-3遍，瀝干水分，蓋上瓶蓋，置于無菌超凈臺備用；

2）再次使用75％酒精對種子表面消毒25-35秒，接著使用0.1％HgCl₂浸泡6-10分鐘，然后用無菌水沖洗5-6遍，清洗完畢后將種子鋪在放有過濾紙的平皿里吹干水分，備用；

3）剝去種子的內外種皮，接種于愈傷誘導培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-12,4-D?和?1.8-2.2?mg?L^-1?6-BA，愈傷誘導培養基中蔗糖含量為2-4%，瓊脂0.6-0.8%，滅菌前將PH調至5.7-5.9，120-125℃下滅菌20-25分鐘；

4）材料接入愈傷誘導培養基后15-18天后開始啟動，待第25-28天的時候誘導出的細密的愈傷組織已經在材料與培養基接觸的外圍長滿了厚實的一圈，淡黃色，泛著些許綠色、晶瑩、剔透，這時再將長有愈傷組織的材料轉移至愈傷組織過渡培養基上，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.1-0.15?mg?L^-1NAA?+?2.0-2.2?mg?L^-16-BA；

5）材料在愈傷組織過渡培養基內進行培養，待愈傷組織由淡黃色變為黃色略帶一點紅色后將材料轉移至愈傷組織分化不定芽培養基內，培養溫度為25±2℃，光照光強為2500～3000?Lx，光照時間為10-12h/d；所述的愈傷組織分化不定芽培養基為MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-1NAA?+?9-11?mg?L^-1?6-BA或者MS基本培養基中加入0.4-0.6?mg?L^-1IBA?+?9-11?mg?L^-16-BA；

6）材料成型并長至3-4cm的芽條，其基部用500-550mg?L^-1的IBA浸沒處理20-25min，然后轉到MV液體培養基的紙橋上在100-200?μmol?m^-2?s^-1下誘導生根；誘導生根階段，采用MV液體培養基加入蔗糖15-20?g?L^-1，20-22天開始啟動，透明略帶紅色的幼根長出，再培養一段時間之后，幼根伸長并逐漸木質化。

2.?如權利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟1）中：第一次消毒清洗時間9-10秒。

3.?如權利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟2）中：再次使用75％酒精對種子表面消毒28-30秒，接著使用0.1％HgCl₂浸泡8-9分鐘。

4.?如權利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟3）中：光照光強為2600～2800?Lx，光照時間為11h/d；所述的愈傷誘導培養基為MS基本培養基中加入0.5?mg?L^-12,4-D?和1.9-2.0?mg?L^-1?6-BA，愈傷誘導培養基中蔗糖含量為3%，瓊脂0.7%，滅菌前將PH調至5.8，122℃下滅菌22分鐘。

5.?如權利要求1所述的耐冬山茶愈傷組織再生植株的方法，其特征在于步驟4）中：光照光強為2600～2800?Lx，光照時間為11h/d；所述的愈傷組織過渡培養基為MS基本培養基中加入0.11-0.13?mg?L^-1NAA?+?2.1?mg?L^-16-BA。