[發明專利]表達副豬嗜血桿菌表面抗原的豬霍亂沙門氏菌減毒疫苗

有效

• 申請號: 201310039113.8
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103421732A
• 公開（公告）日: 2013-12-04
• 發明（設計）人: 金梅林;趙建平;周明光;宋岱松;張強;張安定;石建;康超;徐高原;陳煥春
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/116;A61K39/112;A61K39/102;A61P31/04;C12R1/42;C12R1/21
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 張紅兵

技術領域

本發明屬于動物細菌性疾病基因工程疫苗領域，具體涉及一種無抗性標記表達副豬嗜血桿菌表面抗原基因的重組豬霍亂沙門氏菌減毒疫苗菌株的構建、疫苗制備以及應用。

背景技術

副豬嗜血桿菌(Haemophilus?parasuis，HPS)是常規飼養豬群上呼吸道中的一種常在菌，但在特定條件下可以侵入機體并引起嚴重的全身性疾病，以纖維素性多發性漿膜炎、關節炎和腦膜炎為主要特征(，1910)。近年來鑒于飼養技術的不斷調整以及新型呼吸道綜合征的不斷發生，副豬嗜血桿菌病日趨流行，對國內外養豬業造成了巨大危害。現今副豬嗜血桿菌病的主要防制手段是藥物控制和疫苗接種。但是抗生素的長期添加和不合理使用勢必會導致耐藥菌株不斷增多、耐藥譜日益擴大以及嚴重的藥物殘留，對食品安全和人類健康造成嚴重威脅(周學利，2009)。商用滅活苗和自家苗可在一定程度上控制副豬嗜血桿菌的感染，然而血清型多樣性以及占很大比例的不能分型菌株影響了商品苗的防制效果，因此常常在大規模免疫時失敗。自家苗的保護可能更有針對性，但也經常因為分離到的副豬嗜血桿菌不是真正的致病菌株或不是主要致病血清型而造成免疫無效。

近年來基因工程產業飛速發展，使得疫苗的研發無論在方法上還是在觀念上部發生了重大轉變。當前應用基因工程方法構建沙門氏菌減毒株和利用減毒沙門氏菌作為活載體表達外源抗原研制多聯活疫苗等已成為研究熱點。研究表明減毒沙門氏菌作為疫苗載體具有諸多優點：具有聯合免疫作用，可以穩定表達外源基因，且載體疫苗本身不致病，卻可作為仔豬副傷寒活疫苗；通過自然感染途徑如口服或鼻內接種，可以激發機體的系統免疫和粘膜免疫反應；減毒沙門氏菌可侵入淋巴系統，能更有效激發宿主的體液免疫和細胞免疫，并可產生細胞毒性T細胞殺傷反應；所表達靶抗原無需提純，可直接用于動物體免疫保護，顯著降低疫苗制作成本；另外具有載體菌的免疫佐劑作用、減毒活疫苗的免疫持續性等特點。

20世紀60年代初，中國獸藥監察所房曉文等將豬霍亂沙門氏菌強毒株接種含醋酸鉈的培養基中傳數百代后篩選出一株免疫原性好的弱毒株，命名為豬霍亂沙門氏菌C500。后來該菌株在全國推廣使用，使我國仔豬副傷寒得到有效控制。如今人們已經研制出多種不含抗生素抗性標記的沙門氏菌疫苗系統，其中應用最廣的是asd質粒載體平衡致死系統。沙門氏菌asd(aspartate?semialdehyde?dehydrogenase)基因編碼天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶，該酶是二氨基庚二酸(DAP)生物合成途徑中的必需酶，而DAP是革蘭氏陰性菌細胞壁主要化學成分肽聚糖四肽側鏈的一個重要組分。asd基因缺失株在無外源DAP條件下不能形成完整細胞壁導致溶菌死亡。將目的基因插入含asd的轉移質粒，轉化至asd^-受體菌后形成互補，asd^-沙門氏菌在動物體內不能生存，只有含asd轉移質粒的重組沙門氏菌才能存活，并可穩定地在體內體外表達外源抗原。由于以asd質粒載體平衡致死系統代替抗生素抗性標記，因此應用起來也更加安全。

鑒于豬霍亂沙門氏菌asd質粒載體平衡致死系統具有外源基因表達穩定、不需純化、無抗生素抗性標記等諸多優點，同時基于副豬嗜血桿菌外膜蛋白HbpB的良好免疫原性，將豬霍亂沙門氏菌C500菌株開發為能夠表達副豬嗜血桿菌保護性抗原基因HbpB的重組弱毒活疫苗具有良好的應用前景。

發明內容

本發明的第一個目的在于克服現有技術缺陷獲得一種免疫原性佳和安全性好的可以表達副豬嗜血桿菌HbpB抗原的重組豬霍亂沙門氏菌菌株。

本發明的第二個目的是利用表達副豬嗜血桿菌HbpB基因的重組豬霍亂沙門氏菌菌株制備豬霍亂沙門氏菌-副豬嗜血桿菌二聯基因工程疫苗。

本發明的第三個目的是利用表達副豬嗜血桿菌HbpB基因的重組豬霍亂沙門氏菌菌株制備的豬霍亂沙門氏菌副豬嗜血桿菌二聯基因工程疫苗的應用。

本發明通過以下技術方案實現：

申請人獲得了一株不含抗性標記的表達副豬嗜血桿菌HbpB基因的重組豬霍亂沙門氏菌株，命名為豬霍亂沙門氏菌asd^-C500/pYA-HbpB，Salmonella?choleraesuis?asd^-C500/pYA-HbpB，于2013年1月24日保藏在中國.武漢.武漢大學中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其保藏編號為CCTCC?NO：M2013052。

本發明主要技術路線涉及如下方面：