[發(fā)明專利]一種魚糜制品中肉來源的檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310038401.1
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103131774A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙峰;周德慶;李新光
• 申請（專利權(quán)）人: 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魚糜制品中肉來源的檢測方法，屬于分子生物學(xué)檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)

魚糜是將鮮活的原料魚預(yù)處理后，經(jīng)采肉、漂洗、精濾、脫水、分裝、凍結(jié)而成具有一定保藏期的產(chǎn)品。魚糜制品是以魚糜為主要原料，添加淀粉、調(diào)味料等調(diào)配加工的各種食品，如魚丸、魚糕等。近十年來，我國魚糜制品的生產(chǎn)及其消費量量逐年增加，已成為重要的水產(chǎn)加工品種之一。在魚糜制品的加工過程中，為改善產(chǎn)品的口感、提高產(chǎn)品產(chǎn)量，生產(chǎn)者會在魚糜制品中添加其它肉類，較為常見的是添加雞肉、鴨肉和豬肉。生產(chǎn)者添加了其它肉類后在食品包裝中如不正確標(biāo)注，一方面是欺瞞消費者，損害了消費者的經(jīng)濟(jì)利益，另一方面特定消費者對肉類的選擇有傾向性，如回族不吃豬肉等。

為保護(hù)消費者的利益，需要建立一種有效的區(qū)分魚糜制品中肉來源的檢測方法，以檢測魚糜制品中是否含有雞肉、鴨肉或豬肉。由于魚糜制品的加工方式，肉類成分的感官性狀和免疫原性物質(zhì)遭到破壞，很難通過傳統(tǒng)的方法如感官評定和免疫學(xué)方法來區(qū)分其是否添加了其它肉類成分。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使從DNA水平上對魚糜制品中的肉的來源鑒定成為可能。DNA的性質(zhì)穩(wěn)定，在魚糜制品的加工過程中仍能保持良好的穩(wěn)定性。目前，已有報道采用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法分別對雞肉、鴨肉或豬肉的線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)克隆、測序以及序列比對來鑒別肉的品種。但是這種方法依賴測序結(jié)果進(jìn)行分析，成本較高，檢測周期較長(3-5天)，而且一次只能對一種肉類品種進(jìn)行鑒定。這種測試的時間和測出品種的能力很難滿足實際生活的需要，因此，必須一種檢測成本低、檢測周期短、能一次性檢測出一種或多種肉類的檢測方法，但現(xiàn)有技術(shù)中未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種檢測成本低、檢測周期短、能一次性檢測出一種或多種肉類的魚糜制品中肉來源的檢測方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)手段是：

一種魚糜制品中肉來源的檢測方法，步驟一、DNA提取：用滅菌后的剪刀將魚糜制品剪碎，稱取1g魚糜制品于15mL滅菌的離心管中，加入4mL的TE抽提液，勻漿；加入400μL10％SDS和80μL20mg/ml蛋白酶K充分混勻；將離心管置于65℃的恒溫水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清為止；12000r/min離心30min，取上清液至新的離心管中，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇＝25∶24∶1，緩慢顛倒混勻，12000r/min離心10min；取上清液至新的離心管中，加入2倍體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，上下顛倒數(shù)次，12000r/min離心10min；棄去乙醇，吹干，獲得DNA；然后加入100μL超純水溶解，使用超微量核酸蛋白質(zhì)測定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/μL左右作為模板；

步驟二、多重PCR：多重PCR擴(kuò)增采用50μL的體系，DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR緩沖液5μL，濃度為2.5mmol/L?dNTPs?mixture2μL，雞肉特征引物Gg-F和Gg-R：鴨肉特征引物Ap-F和Ap-R：豬肉特征引物Ss-F和Ss-R＝2∶1∶1，所需的引物濃度均為10μmol/L，5U/μLTaqDNA聚合酶0.4μL，加超純水補(bǔ)充至50μL；PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序分為兩部分，第一部分：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每個循環(huán)依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25個循環(huán)；進(jìn)入第二部分，94℃變性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12個循環(huán)；最后72℃延伸8min；

步驟三、電泳檢測：取5μL?PCR產(chǎn)物與1μL預(yù)染液混合，預(yù)染2～3min，于1.0％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行點樣，120V條件下電泳30min，然后，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照；

步驟四、結(jié)果鑒定：觀察電泳結(jié)果，雞肉、鴨肉和豬肉對應(yīng)的擴(kuò)增片段大小分別為187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，則認(rèn)為結(jié)果為陽性，樣品中含用相對應(yīng)的肉類成分，如無上述大小片段，則認(rèn)為是陰性，樣品中不含有雞肉、鴨肉和豬肉。

進(jìn)一步的，所述步驟一中TE抽提液含有1.5％CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)、0.05mol/LpH8.0的Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷-鹽酸)、0.7mol/L?NaCl、0.01mol/L?pH8.0的EDTA(乙二胺四乙酸)。

進(jìn)一步的，所述步驟二中雞肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鴨肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，豬肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL。