[發明專利]一種魚糜制品中肉來源的檢測方法

有效

• 申請號: 201310038401.1
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103131774A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 趙峰;周德慶;李新光
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院黃海水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種魚糜制品中肉來源的檢測方法，其特征在于：步驟一、DNA提取：用滅菌后的剪刀將魚糜制品剪碎，稱取1g魚糜制品于15mL滅菌的離心管中，加入4mL的TE抽提液，勻漿；加入400μL10％SDS和80μL20mg/ml蛋白酶K充分混勻；將離心管置于65℃的恒溫水浴槽中孵育，直至混合液消化至澄清為止；12000r/min離心30min，取上清液至新的離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1，緩慢顛倒混勻，12000r/min離心10min；取上清液至新的離心管中，加入2倍體積-20℃預冷的無水乙醇，上下顛倒數次，12000r/min離心10min；棄去乙醇，吹干，獲得DNA；然后加入100μL超純水溶解，使用超微量核酸蛋白質測定儀，將DNA濃度稀釋至100ng/μL左右作為模板；?

步驟二、多重PCR：多重PCR擴增采用50μL的體系，DNA模板1μL，含Mg²⁺的10×PCR緩沖液5μL，濃度為2.5mmol/L?dNTPs?mixture2μL，雞肉特征引物Gg-F和Gg-R：鴨肉特征引物Ap-F和Ap-R：豬肉特征引物Ss-F和Ss-R＝2∶1∶1，所需的引物濃度均為10μmol/L，5U/μL?TaqDNA聚合酶0.4μL，加超純水補充至50μL；PCR擴增反應程序分為兩部分，第一部分：94℃預變性5min；94℃變性30s，65℃退火40s，72℃延伸50s；以后每個循環依次降低0.5℃，直到52.5℃，共25個循環；進入第二部分，94℃變性30s，52℃退火40s，72℃延伸50s，12個循環；最后72℃延伸8min；?

步驟三、電泳檢測：取5μL?PCR產物與1μL預染液混合，預染2-3min，于1.0％的瓊脂糖凝膠上進行點樣，120V條件下電泳30min，然后，采用凝膠成像系統拍照；?

步驟四、結果鑒定：觀察電泳結果，雞肉、鴨肉和豬肉對應的擴增片段大小分別為187bp、333bp和515bp，如有上述大小的片段，則認為結果為陽性，樣品中含用相對應的肉類成分，如無上述大小片段，則認為是陰性，樣品中不含有雞肉、鴨肉和豬肉。?

2.根據權利要求1所述的魚糜制品中肉來源的檢測方法，其特征在于：所述步驟一中的TE抽提液含有1.5％CTAB、0.05mol/L?pH8.0的Tris-HCl、0.7mol/L?NaCl、0.01mol/L?pH8.0的EDTA。?

3.根據權利要求1所述的魚糜制品中肉來源的檢測方法，其特征在于：所述步驟二中雞肉特征引物Gg-F和Gg-R各1μL，鴨肉特征引物Ap-F和Ap-R各0.5μL，豬肉特征引物Ss-F和Ss-R各0.5μL。?

4.根據權利要求1所述的魚糜制品中肉來源的檢測方法，其特征在于：所述步驟三中的預染液為6×Loading?buffer：Genefinder核酸染料＝9∶1混合。?

5.根據權利要求1所述的魚糜制品中肉來源的檢測方法，其特征在于：所述引物的序列：雞肉特征引物Gg-F：AGCAGGTGTTTCCTCCAT和Gg-R：GTTGCGGTCGGTAAGTAG，擴增片段187bp；鴨肉特征引物Ap-F：CATTCCTCCTTATACTCGC和Ap-R：ATGTGGTGTTTAGGTTTCG，擴增片段333bp；豬肉特征引物Ss-F：AACCCTACTTGGCGATGA和Ss-R：GTGTTCAGGTTGCGGTCT，擴增片段515bp。?