[發明專利]一種表達豬胰高血糖素樣肽-2的重組嗜酸乳桿菌的構建方法及用途

有效

• 申請號: 201310037473.4
• 申請日: 2013-01-31
• 公開（公告）號: CN103103210A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 侯永清;吳濤;竇茂鑫;趙迪;丁斌鷹
• 申請（專利權）人: 武漢工業學院
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74;C12N1/21;A23K1/18;A23K1/16;C12R1/23
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 狄宗祿

1.一種表達豬胰高血糖素樣肽-2基因的重組嗜酸乳桿菌的構建方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）豬胰高血糖素樣肽-2基因的獲得：提取豬小腸黏膜RNA，經過RT-PCR得到cDNA，以此cDNA為模板，設計合成含有Xma?I和Xba?I酶切位點的上下游引物P1和P2，上下游引物P1和P2分別具有豬glp2基因（Gene?ID：NM_214324.1）的序列，采用PCR方法擴增豬glp2基因片段。將所擴增的glp2目的基因片段與克隆載體pMD18-T載體連接，得到重組質粒，轉入大腸桿菌DH5a中，經過氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，并通過酶切鑒定和測序分析驗證，驗證正確的質粒命名為pMD18T-glp2，重組質粒序列測定表明該質粒具有豬glp2的基因序列。

（2）重組表達載體pMG36e-glp2的構建：將乳酸菌表達載體pMG36e和克隆質粒pMD18T-glp2用限制性內切酶Xma?I和Xba?I進行雙酶切，純化回收雙酶切的線性化的pMG36e載體片段和glp2目的基因片段，并將線性化的載體片段和目的基因片段進行連接，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞中，通過紅霉素抗性篩選，挑取陽性克隆，提取重組質粒，酶切鑒定正確后，命名為pMG36e-glp2，其具有豬glp2的基因序列。

（3）表達豬胰高血糖素樣肽-2的重組嗜酸乳桿菌的構建：采用電轉化方法將重組質粒pMG36e-glp2轉化入嗜酸乳桿菌NZ6092感受態細胞中，利用紅霉素抗性進行篩選，得到重組菌，命名為：NZ6092-glp2。

（4）豬胰高血糖素樣肽-2在嗜酸乳桿菌中的誘導表達及SDS、Western?Blot分析：挑取重組菌NZ6092-glp2接種于含有100ug/mL紅霉素的MRS液體培養基中，誘導表達。得到大小為21Kda左右的蛋白條帶。

2.根據權利要求1所述的一種表達豬胰高血糖素樣肽-2基因的重組益生菌的用途，其特征在于：所述的表達豬胰高血糖素樣肽-2基因的重組益生菌通過飲水或飼料中添加，促進豬胃腸道健康,防治仔豬腹瀉的發生，提高生長性能。