[發(fā)明專利]桑黃菌中環(huán)二肽C3的分離技術(shù)

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310035964.5
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103059032A
• 公開（公告）日: 2013-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋愛榮;趙晨;孫效樂;王光遠(yuǎn);孔超
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07D487/04
• 分類號: C07D487/04;A01G1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程制藥領(lǐng)域。

背景技術(shù)

Phellinus，子實體無柄，菌蓋扁半球形或馬蹄形，2-12*3-21厘米，厚1.5-10厘米，木質(zhì)，淺肝褐色至暗灰色或黑色，老時常龜裂，無皮殼，初期有細(xì)微絨毛，后變無毛，有同心環(huán)棱.邊緣鈍，深肉桂色至淺咖啡色，下側(cè)無子實層.菌肉深咖啡色，硬，木質(zhì).菌管與菌肉近同色，多層，但層次不明顯，年老的菌管層充滿白色菌絲.管口銹褐色至醬色，圓形，每毫米4-5個.孢子近球形，光滑，無色，5-6*3-4微米.剛毛頂端尖銳，基部膨大，10-25*5-7微米.菌絲不分枝，無橫隔，直徑3-5微米。

目前，真菌產(chǎn)物的純化方法較多，主要有分級沉淀法、制備性高效液相層析、柱層析法、超濾法、離心沉淀色譜法、等幾種方法。而其中應(yīng)用最多的當(dāng)屬柱層析法，分為兩類：一是只有分子篩作用的凝膠柱層析，?常用的凝膠有葡聚糖凝膠及瓊脂糖凝膠。二是離子交換層析。但，主要用于分離多糖，透明質(zhì)酸等，多數(shù)分離后得到的產(chǎn)物為混合物。本發(fā)明使用多種層析技術(shù)相結(jié)合，分離度高，應(yīng)用此發(fā)明可以精致到純品。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種桑黃菌（火木層孔菌Phellinus?igniarius(L?ex?Fr)?Quel、裂蹄木層孔菌?phellinus?linteus?(Berk?et?Curt)?Teng?、鮑氏層孔菌、哈蒂針層孔菌?Phellinus?hartigii?(Allesch?et?Schnabl)?Imaz）中環(huán)二肽C3的分離方法。首先制備桑黃菌粗提物，然后進(jìn)行正相硅膠層析，然后是甲醇梯度洗脫，再次進(jìn)行正相硅膠層析，然后是反相制備，再次甲醇凝膠層析，然后HPLC檢測最后是1D-HNMR檢測，即得環(huán)二肽C3，即反式?-?六氫-3?-?（1?-?甲基乙基）吡咯并[1,2-a〕吡嗪-1,4?-?二酮（反式-10e)。該化合物具有抑制植物性毒素、廣譜抗菌和提高腸道細(xì)胞成熟的作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

桑黃粗提物，由下述方法制得：

(1)發(fā)酵培養(yǎng)基配方以克/100毫升計是：

玉米淀粉????1-5%?????????????葡萄糖??????1-5%

蛋白胨?????0.1-0.5%??????????酵母膏?????0.1-0.5%

硫酸鎂?????0.1-0.5%??????????磷酸二氫鉀?0.01-0.05%

(2)將桑黃菌種以常規(guī)方法接種到裝有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶內(nèi)，以20～35℃溫度，搖瓶轉(zhuǎn)速為80～280r/min，pH?3～8條件下，震動培養(yǎng)7～15天；培養(yǎng)中當(dāng)pH值降到2.5～4時，將搖瓶中的種子接種到50L發(fā)酵罐的培養(yǎng)液中，以溫度20～35℃，發(fā)酵罐壓力0.1～0.2公斤/平方厘米，pH?3～8，通氣量0.5～1.1vvm，攪拌速度100～280轉(zhuǎn)/分的條件，培養(yǎng)7～15天，即可利用桑黃菌絲體發(fā)酵全液制備桑黃粗提物；

(3)取步驟(2)中所得桑黃菌絲體發(fā)酵全液，將其以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/2～1/5；

(4)用體積百分比為60～95%的乙醇對上述步驟(3)濃縮后的發(fā)酵液進(jìn)行提取，其中，加入乙醇的量是濃縮液體積的2～5倍，能夠使提取液中乙醇濃度達(dá)到60～90%；

(5)對步驟(4)所得提取液在50～70℃條件下，加熱1～2小時；以常規(guī)方法進(jìn)行分離，并通過二級過濾除去雜質(zhì)，分離獲得乙醇提取液；將上述乙醇提取液以常規(guī)方式減壓濃縮，使其體積濃縮到原體積的1/5～1/10；

(6)將將步驟(5)所得的濃縮液以低溫冷凍干燥的方法進(jìn)行干燥，得桑黃粗提物。

分離環(huán)二肽C3的方法：

桑黃菌粗提物→正相硅膠層析→氯仿與甲醇梯度洗脫→正相硅膠層析→甲醇凝膠層析→TLC檢測→反相硅膠層析→HPLC檢測→甲醇凝膠層析→減壓蒸干→環(huán)二肽C3。

具體方法為：

(1)制備桑黃菌粗提物；

(2)將上述步驟（1）所得的粗提物與正相硅膠混勻攪拌，并干燥，進(jìn)行硅膠正相柱層析，使用洗脫劑洗脫3-4次；

(3)收集上述步驟（2）中最后一次洗脫液，減壓濃縮，使用甲醇溶解，甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫，使用TLC檢測收集的洗脫液，適當(dāng)合并洗脫液，減壓干燥；

(4)將步驟（3）得到的產(chǎn)物再次進(jìn)行甲醇凝膠柱層析，用洗脫劑洗脫；

(5)將步驟（4）得到的產(chǎn)物進(jìn)行反相硅膠層析，洗脫劑為甲醇：水=30%-70%；