[發明專利]一種貽貝肉蛋白抗氧化肽及其制備方法

無效

• 申請號: 201310035469.4
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103204906A
• 公開（公告）日: 2013-07-17
• 發明（設計）人: 王斌;馬佳卉;栗麗;羅紅宇
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12P21/06
• 代理公司: 寧波誠源專利事務所有限公司 33102
• 代理人: 袁忠衛

1.一種貽貝肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為五肽化合物，氨基酸序列為YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)，ESI-MS檢測給出分子離子峰m/z[M+H]+575.26。

2.如權利要求1所述的貽貝肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下述步驟：

1）將洗凈、去殼的貽貝肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，然后按照料液比1g:2~4mL加入異丙醇，于30~35℃中脫脂20~24h，然后于2～6℃、4000~5000rpm離心10~15min除去異丙醇，收集脫脂貽貝肉固形物；

2）所述脫脂貽貝肉固形物按固液比1g:20~25mL加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，調節pH為6.5~7.5，得到混合液；

3）將所述混合液溫度升至55~65℃攪拌預熱10~15min，以所述脫脂貽貝肉固形物的質量為基準加入2.0~4.0%的蛋白酶，在55~65℃酶解2~4h，得到酶解產物；

4）將步驟3）所得的酶解產物升溫至95~100℃后恒溫8~10min后，冷卻至20~25℃，然后離心，得到酶解液；

5）將上述酶解液加入0.05mol/L磷酸鹽緩沖液，使其濃度為20~25mg/mL，按照大孔樹脂重量與酶解液體積1g:40~50mL的比例將酶解液加入到大孔樹脂層析柱中，然后用純度為45～55%的乙醇進行洗脫，最后在溫度40℃以下，真空度-0.1MPa以下旋蒸除去乙醇，濃縮液進行冷凍干燥，得脫鹽酶解物干粉；

6）將上述脫鹽酶解物干粉溶于pH為6.8～7.2的0.04～0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液中配成濃度為8～12mg/mL的溶液，于0.1~0.15MPa的工作壓力和20~25℃的工作溫度下采用超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于1kDa部分，得到超濾酶解液，超濾酶解液凍干后，得到凍干粉末；

7）將上述凍干粉末用pH為6.8～7.2的0.04～0.06mol/L的磷酸鹽緩沖液配成濃度為8～12mg/mL的溶液，加入到陰離子交換樹脂柱，然后分別用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L?NaCl溶液進行洗脫，每5mL洗脫液收集1試管，并根據每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為離子交換酶解液，凍干，得干粉；將所述離子交換酶解液凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）配成10mg/mL的溶液，加入到凝膠層析柱中，用磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L，pH7.0）進行洗脫，每5mL洗脫液收集1試管，并根據每試管洗脫液在280nm下的吸光度繪制洗脫組分曲線圖，其中，DPPH自由基清除活性最高組分為凝膠制備酶解物，凍干，得干粉；

將上述凝膠制備酶解物凍干粉末用0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）配成10mg/mL的溶液，用反相高效液相色譜進行純化，按照280nm下的吸光度曲線和抗氧化活性收集活性最高的多肽，即得高活性抗氧化肽YPPAK(Tyr-Pro-Pro-Ala-Lys)。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟1）中所述的貽貝肉為紫貽貝肉。

4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟3）中所述的蛋白酶為中性蛋白酶，酶活力≥2.0×105U/g。

5.根據權利要求2所述的層析方法，其特征在于所用的大孔樹脂為D101，陰離子交換樹脂為DEAE-52纖維素，所用的凝膠為葡聚糖凝膠G-25；所述反相高效液相色譜條件為：進樣量20μL；色譜柱為Zorbax?C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫為30℃；流動相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈（含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脫：0~55min乙腈濃度從0至50%，每5min增加5%；洗脫速度1.0mL/min；紫外檢測波長為280nm。