[發明專利]一種新型有機-無機復合納米整體酶解柱的制備方法

無效

• 申請號: 201310034717.3
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103131690A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發明（設計）人: 張凌怡;張招娣;高方圓;裴曉良;錢俊紅;張維冰
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N11/14
• 分類號: C12N11/14;C12N11/08
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

【技術領域】

本發明涉及蛋白質酶解技術領域，具體的說，是一種新型有機-無機復合納米整體酶解柱的制備方法。

【背景技術】

以規?；治黾毎蛏矬w內蛋白質為主要任務的蛋白質組學研究已成為后基因組學研究的重要內容。蛋白質組學樣品的復雜性和寬動態范圍使得蛋白質鑒定成為研究的瓶頸。近年來，蛋白質經多維色譜分離后直接流出固定化酶解柱，分離后的蛋白質得以快速酶解后再直接用質譜鑒定。這項技術的核心為固定化酶解柱。固定化酶解柱可顯著縮短蛋白質的酶解時間，減少酶的自降解，易于在線聯用且可反復使用。所以這項技術得到突破，將大大加快蛋白組學的研究進程。

對于膜蛋白等具有重要生理功能的蛋白，由于其疏水性較強，而其跨膜區通常缺少精氨酸或賴氨酸殘基，普遍采用的胰蛋白酶無法實現有效酶解和獲得可信的蛋白質鑒定。利用不同蛋白酶對蛋白質切割特異性的差異并使其共同作用，將大大提高酶解效率，有助于質譜檢測到互補性的肽段，進而提高鑒定結果的可信度。最近，Caterina制備了環氧硅膠整體基質雙酶在線酶解柱，chymotrypsin和trypsin的共同存在不僅縮短酶解時間，而且提高酶解效率和蛋白鑒定的可信度。(Caterina?T，Enrica?C，Karin?C，Guy?F，Gabriella?M，J.Sep.Sci.2009，32，1120-1128)，然而chymotrypsin和trypsin是同時與環氧基反應，所以酶之間存在相互酶解，影響酶的固定量。

【發明內容】

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種新型有機-無機復合納米整體酶解柱的制備方法。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：將修飾活性基團的無機納米材料摻雜到有機整體材料中，在毛細管中制備有機-無機復合基質；對整體材料改性，鍵合活性基團，并將一種蛋白酶與其結合，進一步將第二種蛋白酶結合到納米材料表面的活性基團上，得到含有兩種酶解蛋白的有機-無機復合納米整體酶解柱。

一種新型有機-無機復合納米整體酶解柱的制備方法，具體步驟如下：

一、有機-無機復合基質的制備

將修飾活性基團的無機納米材料摻雜到有機整體材料中，20～80℃下反應12～24h，在毛細管中制備有機-無機復合基質；

所述的無機納米材料為納米二氧化硅、二氧化鈦、氧化鋅、石墨化碳中的一種；粒徑為10nm～500nm；

所述的無機納米材料的形狀為球形、六方柱、棒狀；且無機納米材料表面修飾氨基或羧基活性基團；

所述的無機納米材料的質量mg與有機整體材料的體積mL之比為2∶1～25∶1。

所述的有機整體材料為聚丙烯酰胺整體材料、聚甲基丙烯酸酯整體材料或其它高分子整體材料；

所述的無機納米材料表面結合酶解蛋白，也可以通過在修飾活性基團的無機納米材料上先固定一種蛋白酶的方式引入；

二、對有機整體材料改性，鍵合活性基團

將戊二醛溶液連續泵入步驟一得到的有機-無機復合基質中反應12～24h，對有機整體材料進行改性，在其表面化學鍵合，得到含醛基化的有機-無機復合基質；

所述的有機整體材料的改性，通過質量分數為5～10％的戊二醛引入醛基；

三、蛋白酶的固定

在0～10℃的條件下將含有1～10mg/mL第一種蛋白酶的磷酸鹽緩沖液連續泵入到步驟二得到的有機-無機復合基質中反應12～24h，將此種蛋白酶結合到醛基化的有機-無機復合基質表面；將含有0.1～1mol/L?Cu(II)的水溶液通入鍵合第一種蛋白酶的有機-無機復合基質反應2～10h，將Cu離子螯合到無機納米材料表面的活性基團上，再進一步通入1～10mg/mL第二種蛋白酶磷酸鹽緩沖液將第二種蛋白酶結合到無機納米材料表面的銅離子上；最后用pH為7.0～8.5的緩沖液洗去未固定的第一種蛋白酶和第二種蛋白酶，得到含有兩種酶解蛋白的有機-無機復合納米整體酶解柱。

所述的兩種蛋白酶是通過改性后有機整體材料表面的醛基的共價鍵合作用或氨基酸與銅離子的螯合作用得到固定；

所述的第一種蛋白酶為trypsin、Glu-C、proteinase?K、chymotrypsin、elastase中的一種。

所述的第二種蛋白酶為trypsin、Glu-C、proteinase?K、chymotrypsin、elastase中的一種。

所述的銅離子可通過CuSO4，CuCl₂，，CuNO₃溶液中任一種引入。