[發(fā)明專利]一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310034692.7
• 申請日: 2013-01-30
• 公開（公告）號: CN103966287A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張付云;徐鳳;楊陽;蒼桂璐;王維才
• 申請（專利權(quán)）人: 大連海洋大學(xué);張付云
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;A61K38/16;A61P35/00;A61P35/02;C12R1/10
• 代理公司: 大連非凡專利事務(wù)所 21220
• 代理人: 曲寶威

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域中抗腫瘤蛋白的一種制備方法，特別是一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法。

背景技術(shù)

海帶(Laminaria Japonica Aresch)是一種在低溫海水中生長的大型海生褐藻植物。它生長于水溫較低的海中，分布于中國北部沿海及朝鮮、日本和蘇聯(lián)太平洋地區(qū)沿岸，在中國北部及東南沿海有大量養(yǎng)殖。海帶主要是自然生長，也有人工養(yǎng)殖，多以干制品行銷于市，質(zhì)量以色褐、體短、質(zhì)細而肥厚者為佳。海帶有“長壽菜”、“海上之蔬”“含碘冠軍”的美譽。

海帶作為一種重要的海洋資源，其食用與藥用價值早為世人所知。從海帶中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗HIV 和增強免疫功能,對治療心腦血管疾病和中、早期慢性腎衰等均有一定的作用。海帶中還含有一些共附微生物，但這些微生物及其代謝產(chǎn)物迄今未止還沒有在抗腫瘤方面被充分利用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種操作簡單、成本低廉的海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，使海帶在抗腫瘤方面得以廣泛應(yīng)用。

本發(fā)明的一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，步驟如下：

a、取干凈、新鮮的海帶并滅菌處理，所述的滅菌處理是用75%的酒精和1%的氯化汞對海帶的表面進行滅菌處理；

滅菌處理后對海帶進行研磨，研磨成勻漿，將研磨液均勻涂布于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，在37℃的條件下恒溫培養(yǎng)5~7天；

b、挑取單菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至純菌株；得到地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis；該菌株已于2012年12月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）,保藏號為CGMCC No. 7077；

c、以抑菌活性為指標優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件，優(yōu)化的培養(yǎng)條件為菌株DNN6在pH 9，蔗糖50 g/L和蛋白胨10 g/L的培養(yǎng)基中25℃發(fā)酵6天；

d、8000 r/min離心去除菌體，在上清液中加入硫酸銨，硫酸銨的飽和終濃度為95%，4℃靜置過夜，過濾將沉淀用蒸餾水溶解后，再用截留分子量為3600道爾頓的透析袋透析4天，取透析袋中物冷凍干燥，得到海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白。

本發(fā)明的海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白在抗腫瘤方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的一種海洋地衣芽孢桿菌抗腫瘤蛋白的制備方法，操作簡單、成本低廉，從海帶內(nèi)生地衣芽孢桿菌菌株DNN6的發(fā)酵液中所提取的抗腫瘤活性蛋白抗腫瘤活性強，對小鼠體內(nèi)S180腫瘤生長有抑制活性，對白血病k562細胞株、人肝癌HepG2，乳腺癌MDA-MB-231和MFC-7均有明顯的抑制活性，還可抑制和臍靜脈內(nèi)皮細胞HuvEc，因此可應(yīng)用于抗腫瘤藥品的制備，具有產(chǎn)業(yè)價值。

本發(fā)明中的海洋地衣芽孢桿菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）,保藏號為CGMCC No. 7077。

具體實施方式

本發(fā)明實施例依次按如下步驟進行：

a、將剛打撈的新鮮海帶，在超凈工作臺內(nèi)用無菌水清洗5遍后，再用75%酒精漂洗30-90s（30s一個梯度），無菌水沖洗；0.1%氯化汞漂洗6-18s（6s一個梯度），無菌水沖洗多次。將不同滅菌時間梯度的海帶片都分成兩份，一份用滅菌研缽研碎后接種到培養(yǎng)皿上作為實驗組，另一份直接放入空白培養(yǎng)基做對照組。倒置于37℃溫室中培養(yǎng)5~14天，觀察選取較好的實驗條件，即選擇實驗組中內(nèi)生菌生長良好，而對照組中無菌落長出的滅菌時間梯度作為海帶表面滅菌條件。海帶表面滅菌充分研磨后，將200μL研磨液均勻涂布于現(xiàn)有的牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)5~7天。

b、挑取單個形態(tài)各異的菌落反復(fù)劃線培養(yǎng)至出現(xiàn)純菌株，用濾紙片法檢測各純菌株的抑菌活性作為初步篩選標準。

通過耐鹽性試驗、對溶菌酶抗性試驗、V.P實驗、苯丙氨酸、丙二酸鹽實驗、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)糊精結(jié)晶、油脂水解、淀粉水解、二羥丙酮的形成、過氧化氫酶、酪氨酸水解、產(chǎn)硫化氫、明膠水解、對溶菌酶抗性、石蕊牛乳實驗、糖發(fā)酵、硝酸鹽還原、產(chǎn)生吲哚、動力實驗、卵磷脂酶、甲基紅實驗、酪素水解等生理生化試驗將其鑒定到種，該活性菌株為地衣芽孢桿菌，該菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）,保藏號為CGMCC No. 7077。