[發明專利]使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法

有效

• 申請號: 201310033512.3
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103074359A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 高嵩;陶攀;許恒皓;劉偉;尹欣;程斌
• 申請（專利權）人: 連云港脂立方生物醫藥研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N7/01;C12R1/92
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

技術領域

本發明涉及生物化學及分子生物學領域，具體涉及一種使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法。

背景技術

T4噬菌體的衣殼表面有兩種修飾蛋白，分別為Hoc蛋白和Soc蛋白。此二蛋白為非必要蛋白，即刪除或改造此二蛋白不會對T4噬菌體的復制和擴增造成影響。基于此二蛋白分子的這一特點，并通過分子生物學手段，可將外源蛋白（即非T4噬菌體自身的蛋白）與Hoc或Soc蛋白重組，并展示在T4噬菌體表面。通過分子生物學手段在T4噬菌體表面展示外源重組蛋白的技術，已在疫苗開發方面顯示出巨大的潛在應用價值。

現有的T4噬菌體表面展示技術為體外展示技術。該方案以分子克隆的手段構建Hoc或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的表達質粒，在表達菌體內大量過表達外源重組蛋白。然后以色譜法分離純化過表達的外源重組蛋白，并與Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌體在緩沖液中結合。之后通過差速離心法將未結合的外源重組蛋白與T4噬菌體顆粒分離，從而得到衣殼上展示了外源重組蛋白的T4噬菌體顆粒。現有的T4噬菌體表面展示技術以體外展示為主要手段。這一技術涉及外源重組蛋白的過表達和分離純化，然后再以Hoc蛋白或Soc蛋白缺失的T4噬菌體與之結合。這個過程會面臨：1）外源重組蛋白過表達的表達量問題；2）重組蛋白的溶液可溶性及分離純化效率問題；3）已純化的外源重組蛋白與T4噬菌體表面在緩沖液體系中的結合效率問題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種方法設計合理、可操作性強的使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法，其特點是，其步驟如下：

（一）帶有T4噬菌體天然調控區的Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的表達質粒的構建：

（1）將Hoc蛋白或Soc蛋白的基因編碼區與所需展示的外源蛋白的基因編碼區融合，并在序列上游加入T4噬菌體控制Hoc蛋白或Soc蛋白表達的天然調控區域；外源蛋白選自任意蛋白；融合后形成帶有調控序列的編碼Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的基因序列；含有此序列的質粒在大腸桿菌細胞內會在T4噬菌體感染裝配的過程中同步表達外源重組蛋白；

（2）制備包含質粒復制所需區域和抗生素抗性基因的基因片段；依據所需要的抗性基因和質粒復制區序列，選擇合適的商業可獲得的質粒載體，并通過PCR的方法擴增所選擇的質粒載體的抗性基因和質粒復制所需區域；PCR的方法為：根據所選擇的質粒載體的序列，在質粒復制所需區域和抗性基因的上下游選擇合適區段設計PCR引物；PCR引物的設計基于PCR反應所設計的一對引物覆蓋整個質粒復制所需區域和抗性基因；然后使用質粒載體的DNA為模板，使用標準的Taq酶并按照Taq酶設定的標準PCR循環進行PCR操作；

（3）以DNA連接酶按照商業公司提供的標準方法將從以上步驟獲得的抗生素抗性基因和質粒復制所需區域以及Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的基因片段連接起來，并通過標準的化學轉化法將其轉化進入XL10-Gold感受態細胞內；培養細胞，進行質粒擴增，即得到帶有T4噬菌體天然調控區的Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的表達質粒；

（二）將外源重組蛋白的表達質粒轉化進入大腸桿菌細胞內：以傳統的生物化學方法制作大腸桿菌細胞的感受態細胞，并將外源重組蛋白的表達質粒以標準的化學轉化方法轉化進入大腸桿菌感受態細胞內；

（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌體病毒株感染含有外源重組蛋白表達質粒的大腸桿菌細胞：將含有外源重組蛋白表達質粒的大腸桿菌細胞在37攝氏度搖床中以180-270轉/分鐘的搖速培養至細菌細胞密度1.5-6×10⁸/毫升LB培養基，然后以MOI感染復數=?0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌體感染細胞，并在37攝氏度搖床中以180-270轉/分鐘的搖速培養3-4個小時；個過程中，T4噬菌體不斷裝配擴增，與T4噬菌體裝配同步表達的外源重組蛋白已經展示在T4噬菌體衣殼上；