[發(fā)明專利]使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310033512.3
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103074359A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發(fā)明（設計）人: 高嵩;陶攀;許恒皓;劉偉;尹欣;程斌
• 申請（專利權）人: 連云港脂立方生物醫(yī)藥研究所有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N7/01;C12R1/92
• 代理公司: 南京眾聯(lián)專利代理有限公司 32206
• 代理人: 劉喜蓮

1.一種使用細胞內同步表達法在T4噬菌體表面展示外源蛋白大分子的方法，其特征在于，其步驟如下：

（一）帶有T4噬菌體天然調控區(qū)的Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的表達質粒的構建：

（1）將Hoc蛋白或Soc蛋白的基因編碼區(qū)與所需展示的外源蛋白的基因編碼區(qū)融合，并在序列上游加入T4噬菌體控制Hoc蛋白或Soc蛋白表達的天然調控區(qū)域；外源蛋白選自任意蛋白；融合后形成帶有調控序列的編碼Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的基因序列；含有此序列的質粒在大腸桿菌細胞內會在T4噬菌體感染裝配的過程中同步表達外源重組蛋白；

（2）制備包含質粒復制所需區(qū)域和抗生素抗性基因的基因片段；依據(jù)所需要的抗性基因和質粒復制區(qū)序列，選擇合適的商業(yè)可獲得的質粒載體，并通過PCR的方法擴增所選擇的質粒載體的抗性基因和質粒復制所需區(qū)域；PCR的方法為：根據(jù)所選擇的質粒載體的序列，在質粒復制所需區(qū)域和抗性基因的上下游選擇合適區(qū)段設計PCR引物；PCR引物的設計基于PCR反應所設計的一對引物覆蓋整個質粒復制所需區(qū)域和抗性基因；然后使用質粒載體的DNA為模板，使用標準的Taq酶并按照Taq酶設定的標準PCR循環(huán)進行PCR操作；

（3）以DNA連接酶按照商業(yè)公司提供的標準方法將從以上步驟獲得的抗生素抗性基因和質粒復制所需區(qū)域以及Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的基因片段連接起來，并通過標準的化學轉化法將其轉化進入XL10-Gold感受態(tài)細胞內；培養(yǎng)細胞，進行質粒擴增，即得到帶有T4噬菌體天然調控區(qū)的Hoc蛋白或Soc蛋白與外源蛋白融合的重組蛋白的表達質粒；

（二）將外源重組蛋白的表達質粒轉化進入大腸桿菌細胞內：以傳統(tǒng)的生物化學方法制作大腸桿菌細胞的感受態(tài)細胞，并將外源重組蛋白的表達質粒以標準的化學轉化方法轉化進入大腸桿菌感受態(tài)細胞內；

（三）以Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌體病毒株感染含有外源重組蛋白表達質粒的大腸桿菌細胞：將含有外源重組蛋白表達質粒的大腸桿菌細胞在37攝氏度搖床中以180-270轉/分鐘的搖速培養(yǎng)至細菌細胞密度1.5-6×10⁸/毫升LB培養(yǎng)基，然后以MOI感染復數(shù)=?0.1-1.0用Hoc蛋白和Soc蛋白缺失的T4噬菌體感染細胞，并在37攝氏度搖床中以180-270轉/分鐘的搖速培養(yǎng)3-4個小時；個過程中，T4噬菌體不斷裝配擴增，與T4噬菌體裝配同步表達的外源重組蛋白已經展示在T4噬菌體衣殼上；

（四）分離從以上的感染步驟中產生的展示有外源重組蛋白的T4噬菌體顆粒：以差速離心法將以上感染產物的培養(yǎng)基上清與展示有外源重組蛋白的T4噬菌體顆粒、尚未破裂的大腸桿菌細胞以及感染所產生的細胞殘骸分離開來，離心力34,500g；丟棄上清，并以PI-Mg緩沖液重懸離心所得的沉降物；加入DNaseI至10微克/毫升的終濃度，并在37攝氏度培養(yǎng)30分鐘以消化DNA；之后再以差速離心法去除細胞及殘骸，離心力4,300g，丟棄離心沉降物并保留上清；上清中含有較純的展示有外源重組蛋白的T4噬菌體顆粒；以高速離心的方法將噬菌體顆粒沉降下來，離心力34,500g，去除上清，再以PI-Mg緩沖液重懸噬菌體顆粒，從而獲得具有較高濃度的展示有外源重組蛋白的T4噬菌體顆粒懸浮液，在4攝氏度長期穩(wěn)定保存；

（五）檢測所獲得的T4噬菌體顆粒的衣殼上所展示的外源重組蛋白：對于T4噬菌體顆粒衣殼上所展示的外源重組蛋白，檢測方法的選擇基于外源蛋白本身的性質。