[發明專利]一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法

無效

• 申請號: 201310033326.X
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103039370A
• 公開（公告）日: 2013-04-17
• 發明（設計）人: 張燕梅;周文釗;李俊峰;陸軍迎;林映雪
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

1.一種金邊弧葉龍舌蘭離體培養及再生體系建立的方法，其特征在于：包括如下步驟:

????(1)外植體表面消毒及無菌苗培養

以金邊弧葉龍舌蘭珠芽苗為材料，將外層老葉剝離，流水沖洗，用0.3%高錳酸鉀溶液處理20~40?min，然后在超凈工作臺上用75%酒精處理1~2?min，再用0.1%氯化汞溶液處理15~30?min，最后用無菌水沖洗3-5次，晾干后縱切，接種于HS基本培養基上誘導無菌苗；培養條件為光照12?h，暗培養12?h，光照強度為1500-2000?Lux，培養溫度為26±2?℃；所述的HS基本培養基為：硝酸鉀2500?mg/L，磷酸二氫銨300?mg/L，二水氯化鈣200?mg/L，七水硫酸鎂400?mg/L，一水硫酸錳10?mg/L，七水硫酸鋅1?mg/L，硼酸5?mg/L，碘化鉀1?mg/L，二水鉬酸鈉0.1?mg/L，五水硫酸銅0.2?mg/L，六水氯化鈷0.1?mg/L，七水硫酸鐵27.8?mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L，鹽酸硫胺素0.5?mg/L，鹽酸吡哆醇0.5?mg/L，煙酸0.5?mg/L，肌醇100?mg/L，甘氨酸2?mg/L，?6-芐氨基腺嘌呤6-BA?2.0-5.0?mg/L，HS培養基的pH值為5.8，蔗糖濃度為30?g/L，卡拉膠濃度為8?g/L；

????(2)愈傷組織的誘導

????取步驟（1）培養的無菌苗莖尖，縱切后置于愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織誘導，愈傷組織誘導培養基為MS基本培養基，添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA和萘乙酸NAA；其中6-芐氨基腺嘌呤6-BA的濃度為1.0-3.0?mg/L，萘乙酸NAA的濃度為0.1-1.0?mg/L；培養基的pH值為5.8，蔗糖濃度為30?g/?L，卡拉膠濃度為8?g/?L；培養條件為黑暗24?h，溫度26±2?℃；?

????(3)愈傷組織繼代培養

????將步驟（2）誘導的愈傷組織接種在愈傷組織繼代培養基中進行繼代培養，繼代培養基為MS基本培養基，MS基本培養基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L；?NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L，IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L；培養基的pH值為5.8，蔗糖濃度為30?g/L，卡拉膠濃度為8?g/L；繼代培養條件為：光照12?h，黑暗12?h，光照強度1000?lux，溫度26±2?℃；??

????(4)不定芽誘導

將步驟(3)得到的淺黃綠色愈傷組織轉接到不定芽誘導培養基中進行不定芽誘導，不定芽誘導培養基為HS1基本培養基，培養基添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L；NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L，IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L，培養基的pH值為5.8，蔗糖濃度為30?g/l，卡拉膠濃度為8?g/?L；光照12h，黑暗12h，光照強度為1000?lux，溫度26±2℃；所述的HS1基本培養基為：硝酸鉀2250?mg/L，磷酸二氫鉀400?mg/L，硫酸銨150?mg/L，二水氯化鈣400?mg/L，七水硫酸鎂400?mg/L，一水硫酸錳10?mg/L，七水硫酸鋅5?mg/L，硼酸5?mg/L，碘化鉀1?mg/L，二水鉬酸鈉0.1?mg/L，五水硫酸銅0.2?mg/L，六水氯化鈷0.1?mg/L，七水硫酸鐵27.8?mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L，鹽酸硫胺素0.5?mg/L，鹽酸吡哆醇0.5?mg/L，煙酸0.5?mg/L，肌醇100?mg/L，甘氨酸2?mg/L；

???（5）繼代和生根培養

????待步驟(4)得到的不定芽成苗后轉接到繼代培養基中進行繼代培養，繼代培養所用培養基為HS基本培養基，添加外源激素為6-芐氨基腺嘌呤6-BA、萘乙酸NAA和吲哚3丁酸IBA；其中6-BA的濃度為1.0-5.0?mg/L；NAA的濃度為0.01-1.0?mg/L，IBA的濃度為0.01-1.0?mg/L；待繼代培養的再生植株長到5-8cm時轉入生根培養基中進行生根培養，生根培養所用培養基為不加激素的MS基本培養基，培養基的pH值為5.8，蔗糖濃度為30?g/?L，卡拉膠濃度為8?g/?L；培養條件為：光照12h，黑暗12h，光照強度為1500?lux，溫度26±2℃；所述的HS基本培養基為：硝酸鉀2500mg/L，磷酸二氫銨300?mg/L，二水氯化鈣200?mg/L，七水硫酸鎂400?mg/L，一水硫酸錳10?mg/L，七水硫酸鋅1?mg/L，硼酸5?mg/L，碘化鉀1?mg/L，二水鉬酸鈉0.1?mg/L，五水硫酸銅0.2?mg/L，六水氯化鈷0.1?mg/L，七水硫酸鐵27.8?mg/L，乙二胺四乙酸二鈉37.3?mg/L，鹽酸硫胺素0.5?mg/L，鹽酸吡哆醇0.5?mg/L，煙酸0.5?mg/L，肌醇100?mg/L，甘氨酸2?mg/L；

???(6)?再生植株移栽

待再生植株生根4周，長出4-8條壯根時，將其置于自然條件下煉苗1周，然后將其移出，洗凈基部殘留的培養基，用3%高錳酸鉀浸泡1-3min后移植到基質為火燒土、椰糠和河沙的塑料遮光大棚中，大棚遮光度75%，每天早晚各澆透水1次，再生植株的成活率在90%以上。