[發明專利]一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201310033261.9
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103074436A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 南麗;顏進;王晴晴;吳勇
• 申請（專利權）人: 海爾施生物醫藥股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及多重基因檢測試劑盒及其檢測方法，尤其是涉及一種指導5-氟尿嘧啶用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

5-FU類藥物屬抗代謝類化療藥中的氟尿嘧啶類,這些藥物在體內均轉化為5-FU，抑制脫氧胸苷酸合成酶,從而影響DNA的合成，達到抑制腫瘤的生長的目的。因此該類藥物的使用不可避免地損傷患者體內正常的細胞分裂，出現諸多的化療副作用。5-FU類藥物的抗癌譜很廣，是使用最為廣泛的抗腫瘤藥物之一。但在5-FU類藥物的臨床應用中，卻存在治療有效率低和副作用大的問題，而且存在顯著的個體差異，部分患者獲益，部分患者耐藥并出現嚴重毒副作用。研究表明，人群對5-FU的個體差異與單核苷酸多態性（SNP）密切相關。腫瘤患者在接受5-FU類藥物化療之前，進行5-FU類藥物相關SNP基因位點的監測，根據監測結果制定化療方案，提高腫瘤臨床治療的針對性，減少藥物毒副作用的發生，節約寶貴的醫治時間。

現有的指導5-氟尿嘧啶用藥的單核苷酸多態性（SNP）診斷方法主要為基因芯片法、熒光定量PCR（qPCR）和Sanger測序法。

（1）qPCR檢測方法：采用熒光淬滅及雙末端標記技術，針對SNP位點變異設計特異性的探針。其優點是靈敏度高、準確性強。其缺點是（1）通量低：不適宜多SNP位點的檢測；難以設置內控基因。(2)成本較高：探針標記成本高；若需獲得所有相關SNP信息，需進行多個檢測試驗，疊加成本更加昂貴。

(2)基因芯片法：基因芯片是通過微加工技術，將數以萬計、乃至百萬計的特定序列的DNA片段（基因探針），有規律地排列固定于硅片、玻片等支持物上，構成的一個二維DNA探針陣列，利用這類芯片與標記的生物樣品進行雜交，可對樣品的基因表達譜生物信息進行快速定性和定量分析。DNA芯片：由于高通量等優點在SNP檢測中得到大量應用，依靠野生型與突變型基因雜交動力學的差異對突變位點進行檢測。其優點是：（1）高通量并行檢測；（2）操作簡便快速：整個檢測只需4-8小時基本可以出結果。缺點：1）不同SNP位點之間的雜交動力學差異不同，在進行多位點同時檢測時條件難以控制；2）技術成本昂貴、復雜：每個樣品需要一個芯片，成本大于￥1000/樣品，不利于大規模推廣；探針的合成與固定比較復雜，特別是制作高密度的探針陣列，是主要的限速步驟；3）重復性差，準確性低，易出現假陽性假陰性結果；4）靈敏度較低：芯片法需核酸量較大，一般須先做多重PCR擴增，由于引物較多，容易自身產生二聚體，發夾結構，或由于Tm值不同，而導致擴增目的片段效率不同，進而影響檢測的靈敏度；5）由于芯片的種類較多，難以制定一個統一的質量控制標準。

（3）Sanger（雙脫氧鏈終止法）測序法：Sanger法是根據核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進行熒光標記，產生以A、T、C、G結束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進行檢測，從而獲得可見的DNA堿基序列。其優點是SNP分析金標準，能發現已知SNP，也能發現未知SNP。缺點是每個樣本的每個位點均需要經PCR擴增，跑膠，然后切膠純化，再測序。步驟多而分散，成本較高，工作量大，周期長，多個SNP位點檢測累計價格相對昂貴。

GenomeLab^TMGeXP多重基因表達遺傳分析系統基于貝克曼公司成熟的毛細管電泳分離技術及高靈敏度的激光誘導熒光技術研發而成，一束8道的毛細管陳列設計充分利用了96孔板的排列特性，降低了使用更大的陳列帶來的花費和復雜性。采用多重PCR方法，通過Beckman?Coulter染色標記，在同一個EP管中同時分析多個基因的表達，能快速有效地檢測基因的表達狀況，克服了上述方法存在的缺陷，具有以下優點：

1、高通量：本系統采用雙（96孔）板、自動加樣和樣品追蹤技術，實現單個反應檢測30-40個位點，可同時做192個反應（如192個患者樣品，每個樣品檢測30種腹瀉病毒，30個位點），一天出結果；對于交叉感染患者，本方法可一次性給出準確報告，避免漏檢。

2、準確性強：GeXP采用毛細管電泳對PCR產物進行分離檢測，可將非特異性擴增產物、引物二聚體和特異性擴增產物分離，最大程度降低假陽性；

3、敏感性高，結果重復性好：GeXP系統克服了傳統PCR擴增方法的不均等擴增造成的偏差，提高了對一套目的基因進行定量的速度和敏感性，采用激光誘導熒光-PMT，具有超高靈敏度；