[發明專利]一種D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201310032712.7
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103103167A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 鞠建松;徐書景;趙寶華;李輝欣;馮利偉
• 申請（專利權）人: 河北師范大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/26;C12R1/06;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 董金國

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技術領域

本發明涉及一種原核生物來源的D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白，屬于基因工程和酶工程技術領域。

背景技術

D-氨基酸氧化酶(D-Amino?acid?oxidase:?Oxidoreductase,?DAAO,?EC?1.4.3.3)?是一種以黃素腺嘌呤(Flavin?adenine?dinucletide,?FAD)為輔基的典型黃素蛋白酶類，可氧化D-氨基酸的氨基生成相應的酮酸和氨。反應如下所示：

RCHNH₂COOH??+??E-FAD??→??RC=NHCOOH??+??E-FADH₂

E-FADH_2??+??O₂??→???E-FAD??+??H₂O₂

RC=NHCOOH??+??H₂O??→??RCOCOOH??+??NH_3?

D-氨基酸氧化酶對催化反應底物有高度的立體異構選擇性和廣譜性，可被廣泛用于D-氨基酸的定性定量分析、生物傳感器、L-氨基酸和α-酮酸的生產。20世紀90年代，DAAO在生物技術酶催化方面得以應用，主要用于兩步酶法轉化頭孢菌素C?(Cephalosporin?C,?CPC)生產7-氨基頭孢烷酸（7-aminocephalosporanic?acid,?7-ACA）。DAAO廣泛存在于自然界中，在許多真核生物體中都發現存在DAAO，包括酵母、真菌、昆蟲、兩棲類、爬行類、鳥類和哺乳類。繼豬腎D-氨基酸氧化酶（pig?kidney?D-amino?acid?oxidase?,?pkDAAO）第一個被提取并獲得的純化的黃素蛋白之后，1987年，科學家從纖細紅酵母(Rhodotorula?gracilis)中純化獲得了D-氨基酸氧化酶(RgDAAO)，這也是首次從微生物中純化得到黃素蛋白。目前已有豬腎pKDAAO、纖細紅酵母RgDAAO和人源hDAAO等蛋白晶體結構得到解析。

有關原核生物DAAO的研究報道還很少，僅Birgit?Geueke等人2006年首次也是唯一的一次報道了關于原核生物原玻璃蠅節桿菌(Arthrobacter?protophormiae,?DSM?15035)?中apdaao基因的克隆和表達，酶蛋白ApDAAO具有較為廣泛的底物特異性，其最適反應底物為D-甲硫氨酸，此外對D-賴氨酸、D-精氨酸、D-苯丙氨酸等具有一定活性。有關D-氨基酸氧化酶的商品還很少，目前僅有來自豬腎的D-氨基酸氧化酶pKDAAO得到了很好地開發和應用，然而由于該產品價格昂貴導致成本上升。因此，開發新型的、成本低廉的D-氨基酸氧化酶迫在眉睫。

發明內容

本發明的目的是提供一種酶活力提高的原核生物來源的D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白。

本發明的目的還在于提供一種D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白的制備方法。

本發明的目的是這樣實現的。本發明提供的一種D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。其中：

（1）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第115位的谷氨酸（E）突變為丙氨酸（A）；

（2）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第119位的天門冬酰胺（N）突變為天門冬氨酸（D）；

（3）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第286位的蘇氨酸（T）突變為丙氨酸（A）。

本發明還提供編碼上述突變體酶蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明還提供含有上述基因的載體及宿主細胞。

本發明還提供含有上述基因的工程菌。

本發明還提供上述突變體酶蛋白的制備方法，包括以下步驟：

（1）根據NCBI數據庫中公開的來自原玻璃蠅節桿菌（DSM20168）的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在與同源蛋白序列比對的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物對；

所述的115位突變引物為：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense：????5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突變引物為：