[發明專利]一種D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白及其制備方法

有效

• 申請號: 201310032712.7
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103103167A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 鞠建松;徐書景;趙寶華;李輝欣;馮利偉
• 申請（專利權）人: 河北師范大學
• 主分類號: C12N9/06
• 分類號: C12N9/06;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12Q1/26;C12R1/06;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊新世紀專利商標事務所有限公司 13100
• 代理人: 董金國

1.一種D-氨基酸氧化酶的突變體酶蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，其中：

（1）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第115位的谷氨酸（E）突變為丙氨酸（A）；

（2）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第119位的天門冬酰胺（N）突變為天門冬氨酸（D）；

（3）SEQ?ID?No.1所示的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中第286位的蘇氨酸（T）突變為丙氨酸（A）。

2.一種編碼如權利要求1所述突變體酶蛋白的基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

3.一種制備如權利要求1所述突變體酶蛋白的方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）根據NCBI數據庫中公開的來自原玻璃蠅節桿菌的D-氨基酸氧化酶的氨基酸序列，在與同源蛋白的氨基酸序列比對的基礎上確定突變位點；設計定點突變的突變引物對；

所述的115位的突變引物為：

115位anti-sense：5′-CCTCCCGGGCGGATCTGC-3′；

115位sense：????5′-GGCAGATCCGCCCGGGAG-3′；

119位突變引物為：

119位anti-sense：5′-TCTGCCGGACGGCGCCCAC-3′；

119位sense：????5′-TGGGCGCCGTCCGGCAGAT-3′；

???286位突變引物為：

286位anti-sense：5′-GAGCACGTCGCGGGCCAC-3′；

286位sense：????5′-GTGGCCCGCGACGTGCTC-3′；

（2）以攜帶D-氨基酸氧化酶基因的載體為模板，使用上述設計的引物，利用快速PCR突變技術，構建115/119/286三個氨基酸位點突變的突變質粒；

（3）將上述突變質粒轉化可表達目的基因的工程菌中，隨工程菌的復制表達該突變體酶蛋白。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（2）中表達載體為pET系列中的任意一種。

5.根據權利要求3所述的方法，其特征在于：步驟（3）中工程菌為BL21(DE3)。

6.根據權利要求1所述突變體酶蛋白的應用，其特征在于用于對D-甲硫氨酸、D-苯丙氨酸、D-精氨酸、D-賴氨酸、D-丙氨酸、D-亮氨酸、D-鳥氨酸、

D-纈氨酸、D-脯氨酸和D-組氨酸中D-氨基酸的定性定量檢測。