[發明專利]一種快速檢測船舶壓載水中存活單細胞生物的裝置和方法

無效

• 申請號: 201310032671.1
• 申請日: 2013-01-28
• 公開（公告）號: CN103105352A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 孫野青;宋永欣;彭冉;潘新祥;李冬青
• 申請（專利權）人: 大連海事大學
• 主分類號: G01N15/14
• 分類號: G01N15/14;G01N15/02
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 姜玉蓉;李洪福

技術領域

本發明涉及一種快速檢測船舶壓載水中存活單細胞生物的裝置和方法，尤其涉及一種在微流控芯片上實現對船舶壓載水中存活單細胞生物的全自動檢測、分選、計數和尺寸判定的裝置和方法。

背景技術

船舶壓載水是用于為船舶提供穩性及調整船舶的吃水、吃水差，以滿足船舶良好的操縱性能要求。裝載部分壓載水可以保證船舶在空載或部分空載以及在惡劣海況條件下的航行安全。

船舶壓載水中含有大量的水生生物，并且由船舶壓載水造成的外來海洋生物入侵，已被全球環境基金組織（GEF）確認為危害海洋的四大威脅之一。為更好的管理和控制船舶壓載水，國際海事組織（IMO）于2004年通過了《國際船舶壓載水和沉積物管理與控制公約》（以下簡稱公約），公約強制規定船舶壓載水排放前必須經過處理，并且處理后的船舶壓載水中：（1）最小尺寸大于等于50μm的活體生物個數小于10個/m³；（2）最小尺寸大于等于10μm但小于50μm的活體生物個數小于10個/mL；（3）霍亂菌（O1和O139）的濃度小于1CFU/100mL或1CFU/g浮游動物樣品；（4）大腸桿菌的濃度小于250CFU/100mL；（5）腸道球菌的濃度小于100CFU/100mL。公約還規定：港口國正式授權的官員有權根據相關導則對處理后的船舶壓載水進行取樣采樣,看是否滿足處理標準，但取樣分析時間不能對船舶造成不當的延誤。

一旦公約生效，隨著而來的一個巨大挑戰是港口國如何開展相關的壓載水處理性能的符合性檢查。綜合目前的技術來看，當前微生物檢測和計數方法主要有培養計數法、數字圖像分析法、溶液電阻抗法、顯微攝影法、幻燈測量法、光學顯微鏡計數法、熒光顯微鏡計數法、最可幾率數-聚合酶鏈式反應計數法(MPN-PCR法)、混濁度計數法、流式細胞術法、分子檢測方法和生化活力檢測等方法。但是，這些方法都需要利用實驗室相對成熟的設備和儀器進行分析，體積龐大，費時，不能方便的帶到現場，有些檢測方法無法區分微生物的死活和尺寸。而且，有些檢測儀器需要專門的技術人員操作，因此不適合。

可見，發展面向壓載水公約要求下的海事執法檢查的微型化和便攜化分析儀器和設備具有重要和迫切的研發需求，并且在提高我國海事執法水平、保障航運和保護海洋環境等方面也具有重要意義。

發明內容

為解決現有微生物檢測儀器應用于船舶壓載水檢測存在的上述不足之處，本發明提出采用差分庫爾特電子檢測和激光誘導熒光檢測聯合法，通過電滲驅動樣品流動，在微流控芯片上實現對船舶壓載水中存活單細胞生物的全自動檢測、分選、計數和尺寸判定。由于樣品采用電動驅動和操控，避免了泵閥的使用，可方便的集成為便攜化的檢測儀器。

本發明提供一種快速檢測船舶壓載水中存活單細胞生物的裝置和方法。

一種快速檢測船舶壓載水中存活單細胞生物的裝置，其特征在于，包括PDMS微流控芯片，位于PDMS微流控芯片下方與PDMS微流控芯片封接的玻璃底片G；所述PDMS微流控芯片包括儲液孔A、儲液孔B、儲液孔C、儲液孔D、儲液孔E、主通道、第一聚焦通道、第二聚焦通道、檢測通道、第一分選通道、第二分選通道，儲液孔A與主通道連接，儲液孔B與第一聚焦通道連接，儲液孔C與第二聚焦通道連接，儲液孔D與第一分選通道連接，儲液孔E與第二分選通道連接，第一分選通道、第二分選通道通過檢測通道與主通道連接，第一聚焦通道、第二聚焦通道與主通道連接；儲液孔A、儲液孔B、儲液孔C、儲液孔D、儲液孔E中插入鉑電極，儲液孔A中的鉑電極的另一端與直流電源的正極相連，儲液孔E中的鉑電極的另一端通過電阻R、雙刀雙擲繼電器和電位器連接至直流電源的負極，儲液孔D的鉑電極的另一端通過雙刀雙擲繼電器和電位器連接至直流電源的負極，儲液孔B和儲液孔C中的鉑電極直接與直流電源的負極相連接，電阻R兩端通過導線連接至差分放大電路的兩個輸入端，差分放大電路的輸出端連接至ARM的輸入端；檢測通道的上方設置激光發射探頭，激光發射探頭發射的激光通過第一濾光片進入檢測通道，在玻璃底片G下方對著檢測通道的位置設置第二濾光片，在第二濾光片的下方設置雪崩探測器，雪崩探測器的輸出端連接放大電路的輸入端，放大電路的輸出端連接至ARM。

一種采用權利要求1所述的裝置進行快速檢測船舶壓載水中存活單細胞生物的方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）樣品提取步驟：從待檢測的船舶壓載水中提取船舶壓載水樣品；

2）船舶壓載水樣品以及緩沖液滴加步驟：將采用FDA染料染色后的船舶壓載水樣品加入到儲液孔A中；并向儲液孔A、儲液孔B、儲液孔C、儲液孔D、儲液孔E中分別滴加緩沖液；