[發明專利]一種雜合抗菌肽LPCB及其制備方法

無效

• 申請號: 201310032156.3
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103145805A
• 公開（公告）日: 2013-06-12
• 發明（設計）人: 曹毅;喬代蓉;徐輝
• 申請（專利權）人: 曹毅;喬代蓉;徐輝
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種雜合抗菌肽LPCB及其制備方法。?

背景技術

抗菌肽(Antimicrobial?Peptides，AMPs)是生物體內經誘導產生的小分子多肽，廣泛存在于多種生物體，是機體防御病原體入侵的第一道屏障。大多數抗菌肽都具有廣譜抗菌性，不僅可以抑制多種細菌或真菌，甚至對病毒及腫瘤細胞都有高效的殺傷活性。并且抗菌肽不易產生耐藥性，可作為傳統抗生素的替代品，近年來對抗菌肽的研究已成為一大熱點。但是由于抗菌肽分子小，直接從動植物體內提取分離效率較低，而化學合成的費用昂貴，因此利用基因工程手段對天然抗菌肽進行設計和改造，以獲得抗菌譜更廣、活性更強、減弱或消除其毒副作用的新型抗菌肽是一個理想的選擇。?

專利200910036902.X報道了一種雜合抗菌肽CA-MA的基因工程制備方法，該方法記載了利用家蠅泛素為融合伴侶，構建了高效表達雜合抗菌肽CA-MA的融合表達載體，所獲得的抗菌肽具有高效的抗菌活性和光譜性。但是該方法制備的雜合抗菌肽的溶血性沒有相關報道，CA-MA的安全性也備受質疑。另一方面大腸桿菌系統表達抗菌肽比較困難，主要表現在抗菌肽容易被降解，抗菌肽本身帶有大量的正電荷，對蛋白酶非常敏感，在大腸埃希菌中容易降解，難以實現量產。?

發明專利200610085397.4報道了采用酵母表達系統進行基因工程抗菌肽類天蠶素A-馬蓋寧的制備，該方法記載了根據抗菌肽天蠶素A(cecropinA，CA)N端第1-7個氨基酸殘基，馬蓋寧(magainin，M)N端第2-12個氨基酸殘基，以畢氏酵母偏愛的密碼子設計合成雜合肽CA(1-7)-M(2-12)基因，轉化畢氏酵?母SMD1168，在醇氧化酶啟動子調控下，分子量1.9KD的CecA-Mag雜合抗菌肽獲得表達。然而由于天蠶素A的細胞溶血性較強，存在安全性問題，不適合后續的生產應用。而該專利也沒有報道所制備的雜合抗菌肽的溶血性效果。?

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的缺點，提供一種雜合抗菌肽LPCB，該雜合抗菌肽LPCB具有較高的抑菌活性及熱穩定性，并且溶血性低，安全性得到大大提高。?

本發明的另一目的在于提供一種上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法。?

為了達到上述發明目的，本發明采用的一個技術方案是：提供一種雜合抗菌肽LPCB，其特征在于：它為以下氨基酸序列：?

RRWQWR(P)nKWKIFKKIEK；?

其中，n表示脯氨酸的個數，n＝1～10。?

所述雜合抗菌肽LPCB是在CecropinB成熟肽N端加入LfcinB的核心序列設計而成，它所對應的核苷酸序列為：?

5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)nAAGTGGAAGATATTCAAGAAGATAGAGAAGTAATCTAGAGC-3；其中，n表示脯氨酸密碼子的個數，n＝3～30。?

上述雜合抗菌肽LPCB的制備方法，包括：?

雜合抗菌肽LPCB的基因改造及克?。簠⒄债叧喟退沟陆湍傅钠妹艽a子，改造并合成雜合抗菌肽Lfcin-P-CecropinB基因，并利用SOE法克隆雜合抗菌肽基因，將正確的基因序列與pPICZα-A相連接獲得表達載體pPICZα-A-LPCB，并通過酶切驗證后送出測序，獲得測序正確的表達載體；?

雜合抗菌肽LPCB真核表達載體的構建：將測序正確的表達載體?pPICZα-A-LPCB通過電轉化法轉入畢赤巴斯德酵母Pichia?pastoris?X-33，經甲醇誘導表達，獲得雜合抗菌肽LPCB；采用甲醇進行誘導表達的條件為：在25℃下，每24～36h向培養基中添加0.2～0.5％的甲醇，誘導表達72～96h。?

其中，在利用SOE法克隆基因過程中，所采用的引物為：?

F3：5-CCCTCGAGAAAAGAAGAAGATGGCAATGGAGA(CCA)n₁AAGTGGAAGA-3?

F4：5-GCTCTAGATTACTTCTCTATCTTCTTGAATATCTTCCACTT(TGG)n₂TCTCCATTGCC-3?

其中，n₁＝n₂＝3～30，n表示脯氨酸密碼子的個數。?