[發明專利]一種判定微管相關蛋白1輕鏈3蛋白斑點類型的方法

有效

• 申請號: 201310031926.2
• 申請日: 2013-01-29
• 公開（公告）號: CN103115907A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 駱清銘;張智紅;王亮
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉麗君

技術領域

本發明屬于細胞成像技術領域，具體涉及一種判定微管相關蛋白1輕鏈3蛋白斑點類型的方法。

背景技術

在自吞噬研究領域，經常需要表征細胞內自吞噬結構。微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）蛋白被認為是一種自吞噬結構的標記性蛋白。通常將熒光（FP）蛋白與LC3融合表達于哺乳動物細胞，以便應用熒光顯微鏡動態觀察自吞噬結構的形成與動態變化。在熒光顯微成像中，可見均勻分布于胞漿和細胞核的熒光蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3蛋白（FP-LC3）分子或分布于胞漿中的斑點狀的結構，后者主要代表自吞噬結構。

但是，近5年的最新研究結果表明，這些FP-LC3斑點結構并不一定代表自吞噬囊泡結構，也可能代表LC3分子參與的蛋白聚集體（不含膜成分）。有研究表明，LC3的突變體LC3G120A(LC3□G)可以僅標記蛋白聚集體而不標記自吞噬囊泡結構，因此發展出了利用FP-LC3G120A(FP-LC3□G)來作為自吞噬結構的一個陰性對照。然而，現有的研究結果顯示，雖然在特定條件下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)確實主要標記蛋白聚集體而不標記自吞噬結構，但是在某些情況下FP-LC3G120A(FP-LC3□G)仍然會進入自吞噬囊泡，從而標記自吞噬結構。這表明，FP-LC3G120A(FP-LC3□G)并非一個完美的區分自吞噬結構或者蛋白聚集體的工具。

因此，發展出一種判定LC3斑點類型的方法，在活細胞內快速鑒別自吞噬結構與蛋白聚集體，對于提升生物學研究的準確性具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的目的是提供一種準確、快速判定LC3斑點類型的方法。

本發明所采用的技術方案是：

一種判定微管相關蛋白1輕鏈3蛋白斑點類型的方法，包括以下步驟：

（1）將熒光蛋白（FP）與微管相關蛋白1輕鏈3（LC3）蛋白融合，轉染并表達于哺乳動物細胞中；

（2）對步驟（1）得到的哺乳動物細胞進行處理，使哺乳動物細胞內形成熒光蛋白-微管相關蛋白1輕鏈3蛋白（FP-LC3）斑點；

（3）對步驟（2）得到的FP-LC3斑點進行分析，若FP-LC3與哺乳動物細胞胞漿中的FP-LC3存在完全、快速的交換行為，則FP-LC3斑點的類型為蛋白聚集體；若FP-LC3與哺乳動物細胞胞漿中的FP-LC3存在少量或者不存在交換行為，則FP-LC3斑點的類型為自吞噬結構。

優選地，所述步驟（3）中，分析方法為熒光漂白后恢復（FRAP）方法。

進一步地，所述FRAP方法為：對FP-LC3斑點進行FRAP分析，如果檢測FP-LC3斑點的熒光信號的半恢復時間<1s，恢復程度>80%，則表明該FP-LC3斑點是蛋白聚集體。

優選地，所述步驟（3）中，分析方法為熒光激活后重分布（FRAPa）方法。

進一步地，所述FRAPa方法為：對FP-LC3斑點進行FRAPa分析，如果檢測FP-LC3斑點的熒光信號的半衰減時間<2s，衰減程度>60%，則表明該FP-LC3斑點是蛋白聚集體。

優選地，所述步驟（3）是利用熒光顯微鏡進行觀察。

本發明具有以下優點：

本發明是一種判定LC3斑點類型的方法，該方法的關鍵在于，觀測FP-LC3與哺乳動物細胞胞漿中的FP-LC3是否存在完全、快速的交換行為，如果存在，則表明FP-LC3斑點的類型為蛋白聚集體；若FP-LC3與哺乳動物細胞胞漿中的FP-LC3存在少量或者不存在交換行為，則表明FP-LC3斑點的類型為自吞噬結構。利用本方法可以準確、快速地在活細胞內判定LC3斑點是自吞噬結構還是蛋白聚集體，判定的準確率達到100%，對提升生物學研究的準確性具有重要的應用價值。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中用FRAPa技術判定puromcyin誘導的dendra2-LC3斑點類型的圖；

圖2為本發明實施例2中陰性對照組(未處理組)的圖；

圖3為本發明實施例2中CQ誘導GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑點的圖；

圖4為本發明實施例2中rapamycin誘導GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑點的圖；

圖5為本發明實施例2中陰性對照組中細胞內平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑點的統計的圖；

圖6為本發明實施例2中CQ處理組中細胞內平均GFP-LC3/mCherry-LC3G120A斑點的統計的圖；