[發明專利]基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鑒定及質譜成像的方法

有效

• 申請號: 201310031923.9
• 申請日: 2013-01-24
• 公開（公告）號: CN103969321A
• 公開（公告）日: 2014-08-06
• 發明（設計）人: 陸豪杰;焦競;張瑩;蔡炎;楊芃原
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N1/28
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

技術領域

本發明屬于生化分析領域，涉及一種基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鑒定及質譜成像的方法，具體涉及一種固定化酶原位酶解組織切片實現蛋白鑒定并應用于質譜成像的新方法。

背景技術

現有技術公開了基于生物質譜的組織成像技術作為質譜技術中的一個新領域在迅速發展。它通過直接掃描組織表面，結合專業的圖像處理軟件，將掃描產生的離子信號通過數據處理與圖像重建，獲得組織中化合物的組成，相對豐度及分布情況。該技術已廣泛應用于探測組織切片中的小分子類物質、脂類、多肽和蛋白質的分布，能夠確定病變組織和正常組織中不同部位的特定分子位置及相對含量，能夠跟蹤藥物及其代謝產物的空間分布，因此越來越受到國內外科學家的關注。然而，在分析分子量較大的蛋白時，因其較低的離子化效率和檢測靈敏度，質譜成像技術依然存在一些困難和挑戰。現階段，成像技術中使用的質譜儀器多與飛行時間質量分析器連用，隨著被分析物分子量的增大，其靈敏度隨之下降，且分辨率不足以直接完成對蛋白的鑒定。

現有技術中，發展了用高濃度的有機溶劑處理切片表面以提高成像技術中對蛋白質的檢測效率的方法，但是其操作復雜耗時，易造成切片中蛋白的移位。在傳統蛋白質組學研究中，將蛋白酶解成肽段可使其更易于質譜檢測。現階段的原位酶切技術是將酶液滴點在組織切片上，在適宜的溫度和時間內，將蛋白質在其原有位置上酶切成若干肽段的一項新技術。目前該方法的條件仍有待優化：過高的胰酶量產生的自切肽段將影響低豐度蛋白質的檢測。而胰酶的量過低，因切片厚度非常薄，蛋白含量很低造成不能被有效酶切。因此，亟需發展一種更高效，更便捷的原位酶解的新方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種步驟簡單、操作方便、快速高效的原位酶解方法， 具體涉及一種基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鑒定及質譜成像的方法，該方法結合固定化酶的技術，在短時間內快速酶切組織切片上的蛋白，并應用于質譜成像。

為實現上述目的，本發明采用如下的技術方案：

1.選擇合適的胰蛋白酶固定化材料。

2.利用材料與胰蛋白酶的相互作用將胰酶固定。

3.固定化酶在組織切片上原位酶解后進行質譜分析。

4.利用圖像重構軟件實現組織切片上蛋白分布的確定。

具體的，本發明的基于固定化酶原位高效酶解法的蛋白鑒定及質譜成像的方法，其特征是，選用合適的納米材料作為胰蛋白酶吸附劑，利用其高效的酶解效率實現組織切片原位酶解及蛋白鑒定并應用于質譜成像，其包括步驟：

（1）將離體的組織切片用導電膠帶固定于質譜靶板上；

（2）依次用不同濃度的乙醇溶液潤洗切片表面，每次潤洗一分鐘；

（3）將胰蛋白酶與氧化石墨烯材料按照事宜比例，在磷酸緩沖溶液中混合，4攝氏度條件下孵育；

（4）將固定化酶用25mM碳酸氫銨溶液稀釋后均勻鋪展在組織切片上，并放入37攝氏度恒溫箱，至組織切片表面的溶液完全蒸發；

（5）配制含三氟乙酸和乙腈水溶液配制成CHCA基質溶液，用基質覆蓋儀將基質溶液均勻噴灑在組織切片上，待基質完全干燥后送入質譜儀進行成像分析；

（6）將掃描結果導入成像軟件中，通過圖像重構技術處理，選擇合適的肽段得到組織切片中蛋白分布的質譜成像圖。

本發明中，組織切片的厚度通常為14μm。

本發明中，依次用50%，75%，100%的乙醇溶液潤洗切片表面。

本發明中，潤洗時間為1分鐘。

本發明中，材料與胰蛋白酶的濃度為400ng/μL。

本發明中，磷酸緩沖溶液濃度為20mM（pH5）。

本發明中，其特征是混合比例為1:1。

本發明中，是4攝氏度條件下孵育5分鐘。

本發明中，將固定化酶用25mM碳酸氫銨溶液稀釋10倍。

本發明中，是CHCA基質溶液（5mg/mL,0.1%三氟乙酸50%乙腈）用基質覆蓋儀將基質溶液均勻噴灑在組織切片上。

本發明方法中，優選的具體條件是：

1.組織從負80攝氏度轉移至冷凍切片機，冷凍切片機操作溫度為負18攝氏度，獲取厚度為14μm的組織切片，并用導電膠帶固定于質譜靶板上。

2.依次用50%，75%，100%的乙醇溶液潤洗切片除去脂類等干擾物質，每次潤洗一分鐘。