[發明專利]一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法

無效

• 申請號: 201310031004.1
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103114139A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發明（設計）人: 戴宗;鄒小勇;蔡婷
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

技術領域

本發明涉及一種DNA甲基化測定分析方法，具體涉及一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法。?

背景技術

DNA甲基化是一種廣泛存在于高等生物的重要基因表觀遺傳修飾方式，也是外遺傳體系的一種重要表達調控機制。DNA?甲基化主要發生在5’-CpG-3’的?C，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。大量研究表明，DNA甲基化是在不改變基因堿基序列的情況下，通過改變CpG島的甲基化程度，在轉錄水平上實現調控基因表達，消除潛在危險DNA序列，調節發育過程和各種生理反應等功能。相反，DNA低甲基化和CpG島高甲基化等異常的基因組甲基化，不僅會導致DNA復制延遲、染色體壓縮、轉錄抑制等，而且會影響疾病的易感性、發生發展、預后和轉歸等。近年發現，基因組DNA異常甲基化與多種疾病尤其是年齡相關的慢性疾病的發生密切相關。由于DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，建立準確度高、操作簡單的DNA甲基化檢測方法，對疾病的早期診治和社區干預等具有十分重要的理論意義和實用價值。?

DNA甲基化的檢測研究可分為三個層次：（1）基因組整體甲基化水平檢測，（2）特異位點甲基化水平檢測，（3）新甲基化位點的尋找。常規的DNA甲基化的檢測方法主要依賴甲基化敏感性內切酶在各自識別位點對5-mC和C不同的敏感性進行區分，或重亞硫酸鹽對甲基化和非甲基化胞嘧啶的化學活性不同使DNA包含的甲基化信息轉變為序列的差異信息。方法主要包括甲基化結合蛋白柱層層析，MSssI甲基轉移酶分析和氯乙醛反應法，甲基化特異性PCR（MSP），甲基化敏感性單鏈構象分析，重亞硫酸氫鈉聯合限制性內切酶分析法（COBRA），甲基化敏感性斑點分析，甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳，甲基化敏感單核苷酸引物延伸法（MS-SNuPE），PCR熒光變性曲線分析，變性高效液相色譜法（DHPLC），甲基化熒光檢測（MethyLight），甲基化特異性多連接依賴性探針擴增（MS-MLPA），DNA甲基化微陣列芯片技術等。雖然甲基化檢測方法得到很大發展，但各種方法存在著明顯的限制性。重亞硫酸鹽法要求大量的克隆測序，過程繁瑣、昂貴，同時處理不完全時容易導致假陽性；甲基化敏感性單核苷酸引物衍生技術則存在著實驗步驟略復雜，若要檢測多個位點時，需要設計多個引物和存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題；甲基化敏感性鏈解曲線分析技術等則存在著靈敏度太低的缺點；依賴基因測序或多步的PCR擴增使分析步驟復雜，檢測需時長，測定成本高；使用限制性內切酶只能獲得特殊酶切位點的甲基化水平，不能確定樣品DNA中其它位點的甲基化情況。因此，需要尋找更加簡單、快速的方法。?

電化學方法具有快速，靈敏，不受溶液濁度影響，且儀器簡單、操作方便，使用成本低，無需復雜的前處理過程，易于微型化和實現現場檢測等特點，在DNA甲基化檢測方面具有獨特優勢。近年來，DNA甲基化的電化學檢測方法取得了一定的突破，但從文獻報道來看，DNA甲基化的電化學檢測主要集中在DNA整體甲基化水平的檢測，對特異位點的甲基化水平檢測和新位點尋找的電化學方法鮮有報道。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種基于連接酶反應的多特異位點DNA甲基化電化學檢測方法。?

本發明所采取的技術方案是：?

一種多特異性位點DNA甲基化檢測方法，包括如下步驟：

（1）根據目標DNA序列上的每個特異性甲基化位點的側翼序列設計一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號探針用量子點修飾，檢測不同甲基化位點所使用的信號探針上修飾的量子點不同；

（2）目標DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶；

（3）將分離探針和信號探針加入步驟（2）處理后的目標DNA溶液中進行雜交；

（4）收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應液進行連接反應，反應結束后進行解鏈反應，解鏈結束后，趁熱將固相載體與反應液分離；

（5）收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測定固相載體上連接的量子點的電化學信號；

（6）根據電化學信號的歸屬和強度確定甲基化的位點和甲基化程度。

所述分離探針的長度為35～45?bp，信號探針的長度為10～15?bp，以保證雜交的選擇性。?

所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。?