[發(fā)明專利]一種基于連接酶反應(yīng)的多特異位點(diǎn)DNA甲基化電化學(xué)檢測(cè)方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310031004.1
• 申請(qǐng)日: 2013-01-25
• 公開（公告）號(hào): CN103114139A
• 公開（公告）日: 2013-05-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴宗;鄒小勇;蔡婷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 張海文

1.一種多特異性位點(diǎn)DNA甲基化檢測(cè)方法，包括如下步驟：

（1）根據(jù)目標(biāo)DNA序列上的每個(gè)特異性甲基化位點(diǎn)的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)一組核酸探針，每組核酸探針由一條分離探針和一條信號(hào)探針組成，分離探針用固相載體修飾，信號(hào)探針用量子點(diǎn)修飾，檢測(cè)不同甲基化位點(diǎn)所使用的信號(hào)探針上修飾的量子點(diǎn)不同；

（2）目標(biāo)DNA樣品用重亞硫酸鹽處理，使未被甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶；

（3）將分離探針和信號(hào)探針加入步驟（2）處理后的目標(biāo)DNA溶液中進(jìn)行雜交；

（4）收集固相載體，清洗后加入DNA連接酶反應(yīng)液進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行解鏈反應(yīng)，解鏈結(jié)束后，趁熱將固相載體與反應(yīng)液分離；

（5）收集固相載體，清洗后利用溶出伏安法測(cè)定固相載體上連接的量子點(diǎn)的電化學(xué)信號(hào)；

（6）根據(jù)電化學(xué)信號(hào)的歸屬和強(qiáng)度確定甲基化的位點(diǎn)和甲基化程度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分離探針的長度為35～45?bp，?信號(hào)探針的長度為10～15?bp。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相載體為磁性微球、聚四氟乙烯微球、金片、或表面修飾有羧基或氨基的微米材料。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分離探針的制備方法如下：固相載體分別用100?mM咪唑緩沖溶液和EDC/NHS溶液處理后，加入核酸分子，35～45℃下振蕩反應(yīng)1～3小時(shí)，分離，分別用2×SSC緩沖溶液（0.5%?SDS）和65℃高純水清洗，得到分離探針。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述信號(hào)探針的制備方法如下：量子點(diǎn)水溶液與核酸分子混合，在N₂保護(hù)下攪拌16～24小時(shí)，逐滴加入PBS（pH?7.4，0.24?M?NaCl，0.1%?NaN₃）后在PBS（pH?7.4，0.2?M?NaCl）中透析36～48小時(shí)，離心收集制備的信號(hào)探針。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3）所述雜交的條件為：35～45℃下雜交1～3小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）所述連接酶反應(yīng)液的組成為：30?mM?Tris-HCl，4?mM?MgCl₂，10?mM?(NH₄)₂SO₄，0.005%?BSA，0.2?mM?NAD和0.5?U/L?Ecoli?DNA連接酶。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）所述連接反應(yīng)的條件為：35～40℃下反應(yīng)1～2小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（4）所述解鏈的條件為：85～95℃下解鏈5～15分鐘。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（5）測(cè)定溶出伏安曲線的條件為：玻碳電極在300～500μg/L鉍溶液中，－0.9～－1.1?V沉積10分鐘。