[發明專利]純白色真姬菇Finc-W-247的分子標記及其獲得方法與應用

有效

• 申請號: 201310030553.7
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103289998A
• 公開（公告）日: 2013-09-11
• 發明（設計）人: 劉玉
• 申請（專利權）人: 上海豐科生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/10;C12Q1/68
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司 31236
• 代理人: 胡晶

【技術領域】

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種純白色真姬菇Finc-W-247的分子標記及其獲得方法與應用。

【背景技術】

真姬菇（拉丁文名稱Hypsizygus?marmoreus），隸屬擔子菌亞門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬，因它具有獨特的蟹鮮味，故又稱它為蟹味菇。最初的人工栽培于1978年前后開始于日本，其味道鮮美、食感脆嫩、營養豐富，其味比平菇鮮，其肉比滑菇厚，其質比香菇韌，口感甚佳，其干品還香味濃溢。真姬菇含有豐富的維生素和17種氨基酸，子實體中提取的β-葡聚糖具有很高的抗腫瘤活性，是一種低熱量、低脂肪的保健食品。

傳統食用菌菌種鑒別，尤其對于真姬菇，其主要依據是子實體的外觀形態、拮抗試驗、出菇對比等。外觀形態易受栽培環境和配方的影響，造成外觀形態鑒定的困難。親緣關系較近的菌株之間（比如，有些親本和子代之間），拮抗現象不明顯，通過拮抗試驗鑒別菌種也存在困難。出菇對比試驗耗時至少4個月，不利于菌種的鑒定和檢測。隨著分子生物學的發展，分子標記法越來越廣泛地用于菌種的鑒別。SCAR（Sequence-characterized?Amplified?Region）標記是一種十分穩定的分子標記，能夠簡便、快速、穩定的進行菌種鑒定，但目前尚未有對純白色真姬菇Finc-W-247的SCAR分子標記，以快速鑒定純白色真姬菇Finc-W-247。

【發明內容】

本發明解決的技術問題是克服現有技術存在的缺陷，提供一種純白色真姬菇Finc-W-247的分子標記及其獲得方法與應用。

本發明采用PCR技術進行了大量的篩選試驗，其中，采用隨機引物（序列為：GTCCCGACGA）獲得了真姬菇Finc-W-247菌株或其子實體的特異DNA片段，分子量為989bp，將該片段克隆測序，以此片段的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，其特異引物對序列為：5’-GACGACGTTTGTGGGGTGA-3'和5’-AGGGAGATCGACGTCCATATTG-3'。該引物對對真姬菇Finc-W-247菌株或其子實體進行SCAR-PCR擴增，可以獲得分子量大小為975bp的特異片段，即為純白色真姬菇菌株Finc-W-247的分子標記。

本發明還公開一種一種純白色真姬菇Finc-W-247的分子標記的獲得方法，其特征在于包括如下步驟：

1）獲得菌絲或者子實體；

2）基因組DNA提取；

3）RAPD法分析并獲得特異DNA片段：采用RAPD法分析，獲得純白色真姬菇Finc-W-247的特異DNA片段，獲得該片段對應的隨機引物序列為：GTCCCGACGA；

4）特異引物設計：以上述獲得的特異DNA片段序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對序列是5'-GACGACGTTTGTGGGGTGA-3'和5'-AGGGAGATCGACGTCCATATTG-3'；

5）SCAR分子標記的PCR擴增：用特異PCR擴增引物對純白色真姬菇Finc-W-247的基因組進行SCAR-PCR擴增，得到975bp的特異分子標記。

6）電泳檢測。

所述步驟3）RAPD法的PCR擴增反應體系為：總體積25μL：基因組模板20-30ng/μL1.0μL，隨機引物0.5pmol/μL1.0μL，10mM?dNTP?mix0.5μL，10×Taq緩沖液2.5μL，25mM?MgCl₂2.0μL，Taq酶5U/μL0.25μL，加水至25μL。PCR反應條件：預變性95℃3min；94℃45s，36℃60s，72℃2min，35個循環；72℃延伸10min。純白色真姬菇Finc-W-247菌株或其子實體特異DNA片段大小為989bp。

所述步驟5）中SCAR分子標記的PCR擴增，其體系為：總體積25μL，模板20～30ng/μL1μL，真姬菇Finc-W-247特異引物對0.5pmol/μL各0.5μL，10mM?dNTP?mix0.5μL，10×Taq?Buffer2.5μL，25mM?MgCl₂2.0μL，Taq酶5U/μL0.25μL，加水至25μL。PCR反應條件：預變性95℃3min；94℃30s，62℃30s，72℃1min，35個循環；72℃延伸5min。