[發明專利]一種蘇丹草胚接種轉基因技術

無效

• 申請號: 201310029246.7
• 申請日: 2013-01-27
• 公開（公告）號: CN103074367A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 李杰勤;王麗華;詹秋文;趙庭;周青;萬海波;王茂輝
• 申請（專利權）人: 安徽科技學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

一種蘇丹草胚接種轉基因技術涉及生物技術領域中的植物轉基因技術。

背景技術

蘇丹草轉基因技術是采用生物技術方法改造蘇丹草品種，培育具有高產、優質、抗蟲、抗病等優良特性新品種的最為有效的技術手段。目前蘇丹草的轉基因一般都采用農桿菌侵染愈傷的方法，該方法先要進行愈傷誘導，然后農桿菌侵染，再用組織培養的方法獲得轉基因苗。由于蘇丹草組織培養難度較大，因此該方法的效率較低，應用困難。

發明內容

本發明的目的是采用一種新的技術路線進行蘇丹草轉基因的接種處理，以期達到方法易行，操作簡單，費用低廉，效果良好的技術效果。

本發明是這樣實現的：

1.?一種蘇丹草胚接種轉基因技術包括接種液接種和暗箱培養，其特征在于，以蘇丹草種子為載體，進行刺胚接種加接種液反復真空浸泡、充分接種。它包括①制備雙元載體接種液、②蘇丹草種子消毒、③無菌水浸種、④刺胚接種、⑤接種液抽真空浸種、⑥暗箱培養、⑦育苗栽培7個步驟。

2.上述7個步驟的具體實施過程如下：

①制備雙元載體接種液：將已經轉入雙元載體的農桿菌接種到100mL的YEP液體培養基中培養2天（培養基中加入100μL的潮霉素和利福平），培養溫度為28℃。

②蘇丹草種子消毒：選取飽滿的蘇丹草種子先后用乙醇和84消毒液消毒，消毒結束后用滅菌水洗凈種子。

③無菌水浸種：將種子轉入滅菌水中28℃浸泡2-24小時，使種子充分吸脹。

④刺胚接種：將吸脹的種子取出置于已滅菌的培養皿中，用已消毒的鋼針蘸取OD₆₀₀為0.6的農桿菌接種液扎刺胚芽，深度大約為1mm。

⑤接種液抽真空浸種：將刺完的種子放在含有200μmol/L乙酰丁香酮的農桿菌接種液中抽真空（-0.1MPa）浸種30min，恢復常壓后再抽真空（-0.1MPa）浸種5min。

⑥暗箱培養：將種子置于發芽盒中，22℃恒溫培養箱暗濕潤培養4天。

⑦育苗和鑒定：將培養后的種子單粒播到營養缽中，置于合適的溫度生長，3葉期即可進行轉基因植株的鑒定。

本發明的有益效果：一種蘇丹草胚接種轉基因技術避開了傳統的農桿菌侵染愈傷后再組織培養的技術路線，與現有方法相比有以下幾個優點：第一，所需時間減少2個月左右，農桿菌浸染法從愈傷誘導到獲得轉基因植株一般需要3-4個月，本方法從接種開始到鑒定完成僅需1個月；第二，本方法對技術要求不高，而蘇丹草組織培養難度大，愈傷易褐化，因此對實驗者的技術和實驗的條件要求高，而本方法不涉及組織培養過程，因此大大降低了技術難度和實驗條件；第三，本方法所需費用較少，現有的轉基因技術需要借助植物組織培養技術，而組織培養的各種試劑較貴，而且需要建立組培室并配備大量的儀器設備才能開展工作，而本發明免除了這部分的花費，節約了大量資金。

具體實施方式：

下面結合具體實例對本發明進行進一步的描述。

實施例1：將S1305GFP載體轉入到蘇丹草Sa植株中

①制備雙元載體接種液：將已經轉入S1305GFP基因的雙元載體的農桿菌接種到100mL的YEP液體培養基中培養2天（培養基中加入100μL的潮霉素和利福平），培養溫度為28℃。

②蘇丹草種子消毒：選取400粒飽滿的蘇丹草Sa首先用70%乙醇消毒3min，然后用84消毒液消毒40min，消毒結束后用滅菌水漂洗4次，洗凈種子。

③無菌水浸種：將種子轉入滅菌水中30℃浸泡24小時，使種子充分吸脹。

④刺胚接種：將吸脹的種子取出置于已滅菌的培養皿中，用已消毒的鋼針蘸取OD₆₀₀為0.6的農桿菌接種液扎刺胚芽，深度大約1mm。

⑤接種液抽真空浸種：將刺完的種子放在含有200μmol/L乙酰丁香酮的農桿菌接種液中抽真空（-0.1MPa）浸種30min，恢復常壓后再抽真空（-0.1MPa）浸種5min。

⑥暗箱培養：將處理好的N108種子置于發芽盒中，22℃恒溫培養箱暗濕潤培養4天。

⑦育苗和鑒定：將培養后的種子單粒播到營養缽中，置于22℃下生長，3葉期進行轉基因植株的鑒定。

經鑒定，通過以上步驟在23株Sa幼苗中獲取了2株轉基因植株。歷時8天，比現有的轉基因技術減少80天左右。