[發明專利]一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片及其篩選方法

有效

• 申請號: 201310028300.6
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103103272A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 劉學端;邱冠周;覃文慶;梁伊麗;尹華群;郭雪;申麗;劉新星
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/02;C40B50/14
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

技術領域

本發明涉及從酸性浸礦微生物群落中快速篩選新穎基因的宏基因組芯片及篩選方法。

背景技術

酸性浸礦體系中，浸礦微生物群落通過氧化分解礦物使金屬離子進入溶液。了解浸礦微生物群落的代謝調控與浸出過程的關系，發掘關鍵代謝途徑相關的新穎基因有助于提高微生物冶金的效率。

利用傳統方法研究微生物的代謝調控或者功能基因，必須先分離純化微生物，然后通過形態觀察或生理生化檢測分析其代謝調控方式。新基因的研究，則要通過體外表達和酶學測定確定其功能特性。然而，極端酸性浸礦體系中的大部分微生物難以分離純化培養，利用傳統的方法難以開展代謝調控和基因功能的研究。

發明內容

本發明的目的在于通過構建酸性浸礦微生物群落宏基因組大片段文庫，提供一種宏基因組基因芯片，以及利用該芯片快速篩選宏基因組文庫中的新穎目標基因的方法，從而獲得不能分離純化培養的微生物的遺傳基因信息，解決傳統方法無法分析未分離純化培養微生物遺傳和代謝調控特性的難題。

一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片，是由以下方式構建的：

利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構建大片段的宏基因組文庫，以宏基因組文庫中提取的7776個fosmid質粒為探針，將探針通過基因芯片點樣儀打印在玻片表面，打印后的宏基因組芯片在室溫下干燥過夜，最后使用紫外交聯儀照射下進行交聯即可。

具體包括以下步驟：

采用0.2μm的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然后利用200μl的小槍頭進行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl?pCC1FOS?Vector質粒（Epicentre）連接起來構建重組的fosmid質粒；然后將重組的fosmid質粒轉化到EPI300-T1^R?Plating大腸桿菌感受態細胞（Epicentre）；將轉化后的大腸桿菌細胞液均勻地涂布在含有氯霉素的LB培養基上，過夜培養，挑取陽性克隆子構成含有7776個克隆子的宏基因組文庫；每個克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段，

利用誘導劑誘導宏基因組文庫中的克隆子，使重組fosmid質粒在細胞中的拷貝數達到至少50個，然后提取宏基因組文庫中每個克隆子的fosmid質粒，用紫外吸收法測定質粒的濃度，調節濃度為50ng/μl儲存；將10μl的fosmid?DNA與40%的二甲基亞砜按體積1:1的比例混合，用芯片點樣儀，在相對濕度為50-55%的條件下將fosmid?DNA樣品打印在硅化玻片表面；樣品點之間的距離為250μm，打印好的芯片室溫干燥過夜后紫外照射使核酸分子與玻片交聯固定。

將探針在芯片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個亞矩陣，每個探針在芯片上有2個陣列重復。

所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。

利用上述的宏基因組芯片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，包括以下步驟：PCR擴增待篩選目標基因并進行熒光標記：將經標記后的PCR產物與宏基因組芯片雜交，獲取陽性雜交信號數據，通過PCR驗證，然后通過測序對應宏基因組文庫中的克隆子得到目標基因的完整序列信息。

與傳統方法相比，本發明芯片及方法能夠快速的篩選目標基因，提高了基因文庫的利用效率，避免了重復建庫篩選文庫利用率低的弊端。同時，這種方法不要求微生物必須是純培養物，所以可以有效地篩選到未分離純化微生物的新穎基因。

附圖說明

圖1為16sRNA基因宏基因組雜交結果；

圖2為宏基因組芯片質粒濃度與信號關系；

圖3為SAOR基因PCR擴增電泳圖；

圖4為SAOR不同基因型在群落中所占比例；

圖5為SAOR基因宏基因組芯片掃描圖；

圖6為德興銅礦浸礦水中的細菌微生物SAOR基因的系統發育樹。

具體實施方式

以下結合實施例旨在進一步說明本發明，而非限制本發明。

實施例1

宏基因組文庫的制備