[發明專利]一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片及其篩選方法

有效

• 申請號: 201310028300.6
• 申請日: 2013-01-25
• 公開（公告）號: CN103103272A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 劉學端;邱冠周;覃文慶;梁伊麗;尹華群;郭雪;申麗;劉新星
• 申請（專利權）人: 中南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C40B40/02;C40B50/14
• 代理公司: 長沙市融智專利事務所 43114
• 代理人: 袁靖

1.一種篩選酸性浸礦體系中新基因的宏基因組芯片，其特征在于，是由以下方式構建的：

利用德興酸性礦坑廢水中微生物群落的總DNA構建大片段的宏基因組文庫，以宏基因組文庫中提取的7776個fosmid質粒為探針，將探針通過基因芯片點樣儀打印在玻片表面，打印后的宏基因組芯片在室溫下干燥過夜，最后使用紫外交聯儀照射下進行交聯即可。

2.如權利要求1所述的宏基因組芯片，其特征在于：構建具體包括以下步驟：

采用0.2μm的尼龍膜過濾酸性浸礦體系中的酸性浸出液，得到生物質富集物，液氮研磨法提取微生物群落總DNA，然后利用200μl的小槍頭進行切割，將總DNA修剪成40-50Kb的隨機的大片段；通過DNA的末端修飾使其末端成為兩條鏈平齊的鈍末端，利用DNA快速連接酶將DNA大片段與CopyControl?pCC1FOS?Vector質粒連接起來構建重組的fosmid質粒；然后將重組的fosmid質粒轉化到EPI300-T1^R?Plating大腸桿菌感受態細胞；將轉化后的大腸桿菌細胞液均勻地涂布在含有氯霉素的LB培養基上，過夜培養，挑取陽性克隆子構成含有7776個克隆子的宏基因組文庫；每個克隆子中都含有一段40-50Kb的插入DNA片段；

利用誘導劑誘導宏基因組文庫中的克隆子，使重組fosmid質粒在細胞中的拷貝數達到至少50個，然后提取宏基因組文庫中每個克隆子的fosmid質粒，測定質粒的濃度，調節其濃度為50ng/μl儲存；將10μl的fosmid?DNA與40%的二甲基亞砜按體積1:1的比例混合，用芯片點樣儀，在相對濕度為50-55%的條件下將fosmid?DNA樣品打印在硅化玻片表面；樣品點之間的距離為250μm，打印好的芯片室溫干燥過夜后紫外照射使核酸分子與玻片交聯固定。

3.如權利要求2所述的宏基因組芯片，其特征在于：將探針在芯片上排列成18行36列的亞矩陣，共排列26個亞矩陣，每個探針在芯片上有2個陣列重復。

4.如權利要求1所述的宏基因組芯片，其特征在于：所述的酸性浸礦體系為江西德興銅礦的酸性浸礦體系。

5.利用權利要求1-4任一項所述的宏基因組芯片篩選浸礦體系微生物群落中的新基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：PCR擴增待篩選目標基因并進行熒光標記：將經標記后的PCR產物與宏基因組芯片雜交，獲取陽性雜交信號數據，通過PCR驗證，然后通過測序對應宏基因組文庫中的克隆子得到目標基因的完整序列信息。