[發(fā)明專利]一種利用探針熔解技術(shù)準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310027935.4
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103088137A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳超;戴鵬高;劉金輝;宿志瑞;鄒暉
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標(biāo)代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種利用探針熔解技術(shù)檢測KRAS基因突變的方法。?

背景技術(shù)

基因突變是指基因組DNA分子在結(jié)構(gòu)功能上發(fā)生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導(dǎo)致基因型疾病的重要原因之一。基因突變分析在生物醫(yī)學(xué)研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響細(xì)胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號傳遞給下游細(xì)胞因子后恢復(fù)非激活狀態(tài)；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號活化便始終處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結(jié)合，阻斷細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而達(dá)到抑制癌細(xì)胞增殖的目的；多項研究發(fā)現(xiàn)，接受抗EGFR藥物治療的結(jié)直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益：具有更高的藥物客觀反應(yīng)率和較長的生存時間。因此，能夠準(zhǔn)確檢測KRAS突變狀態(tài)對指導(dǎo)結(jié)直腸癌患者臨床用藥有重要意義。?

傳統(tǒng)檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經(jīng)典是雙脫氧測序技術(shù)，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(yīng)(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術(shù)。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數(shù)方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數(shù)方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結(jié)果，準(zhǔn)確度和靈敏度受到限制。近年來，等位基因特異性PCR(Allele-specific?PCR，ARMS)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(shù)(Pyrosequencing)等方法改善了檢測的靈敏度和特異性，但仍存在假陽性現(xiàn)象嚴(yán)重和操作繁瑣等缺點。?

分子信標(biāo)探針(Molecular?Beacon)是一種可以自發(fā)形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記?寡核苷酸探針，其5’末端標(biāo)記有熒光基團(tuán)，3’末端標(biāo)記有淬滅基團(tuán)；當(dāng)頸環(huán)結(jié)構(gòu)形成后，熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離靠近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，熒光基團(tuán)被外界光源激發(fā)后發(fā)出的光子被淬滅基團(tuán)吸收，此時探針不能被激發(fā)出熒光；若體系中存在與探針序列相匹配的模板，當(dāng)分子信標(biāo)探針與模板雜交后，其發(fā)夾結(jié)構(gòu)被打開，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)空間距離增大，此時熒光基團(tuán)被激發(fā)出的熒光未被淬滅，可以檢測熒光信號；同時由于熒光強度與體系中模板的量呈正比，故分子信標(biāo)探針可以用于實時定量PCR反應(yīng)。當(dāng)分子信標(biāo)與模板鏈雜交后，若繼續(xù)升高溫度可導(dǎo)致探針與模板再次分離，從而使得熒光強度隨溫度升高而降低。將熒光強度對溫度變化時間求導(dǎo)數(shù)便得到熔解曲線，熔解曲線的峰值為熒光信號降低速率最大時對應(yīng)的溫度，即為模板與探針結(jié)合強度(Tm值)。由于序列的差別，探針與野生型模板和突變型模板的結(jié)合強度有差別，表現(xiàn)在熔解曲線(熔解峰)的不同。傳統(tǒng)的熔解曲線法靈敏度較低，使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。?

發(fā)明內(nèi)容

為了克服傳統(tǒng)探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點，本發(fā)明提出一種利用探針熔解技術(shù)準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，不僅節(jié)省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，檢測結(jié)果更可靠。?

為實現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下基本技術(shù)方案。?

一種利用探針熔解技術(shù)準(zhǔn)確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟：?

（1）分子信標(biāo)探針和模板擴(kuò)增引物的設(shè)計及合成?

上游引物(22nt):?

5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’?

延伸阻滯引物(36nt):?

5’-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’?

分子信標(biāo)探針(34nt):?

FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2?

（2）提取被測樣本的基因組DNA；?

（3）配制反應(yīng)體系?

在反應(yīng)管中加入被測樣本的基因組DNA、上游引物、延伸阻滯引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM?Taq?DNA?Polymerase)，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脫氧尿苷三磷酸)、分子信標(biāo)探針、10×PCR?Buffer(TIANNIUM^TM?Taq?PCR?Buffer)；?