[發明專利]一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法

有效

• 申請號: 201310027935.4
• 申請日: 2013-01-18
• 公開（公告）號: CN103088137A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 陳超;戴鵬高;劉金輝;宿志瑞;鄒暉
• 申請（專利權）人: 陜西北美基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 西安智邦專利商標代理有限公司 61211
• 代理人: 陳廣民

1.一種利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟：

（1）分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成

上游引物(22nt):

5’-CAGACTGTGTTTCTCCCTTCTC-3’

延伸阻滯引物(36nt):

5’-taAGGTCAAGAGGACTCATGTACTGGTCCCTCATTG-3’

分子信標探針(34nt):

FAM-acgcATTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTatgcgt-BHQ2

（2）提取被測樣本的基因組DNA；

（3）配制反應體系

在反應管中加入被測樣本的基因組DNA、上游引物、延伸阻滯引物、UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)、5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM?Taq?DNA?Polymerase)，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、dUTP(脫氧尿苷三磷酸)、分子信標探針、10×PCR?Buffer(TIANNIUM^TM?Taq?PCR?Buffer)；

（4）PCR反應

將配制好的反應體系在熒光實時定量PCR儀上進行擴增和熔解，PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發生了KRAS突變。

2.根據權利要求1所述的利用探針熔解技術準確檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于：

以單管反應體系25μl計，反應管中加入上游引物600nM，延伸阻滯引物60nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0.2U，5’→3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM^TM?Taq?DNA?Polymerase)0.5U，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)200μM，dUTP(脫氧尿苷三磷酸)400μM，分子信標探針250nM，10×PCR?Buffer(TIANNIUM^TM?Taq?PCR?Buffer)2.5μl，ddH2O補足體積25μl。

3.根據權利要求2所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于：

PCR反應參數設置如下：50℃，2~5min；95℃，12~15min；95℃，1~5sec；56℃，0~1sec；65℃，0~1sec；60~70個循環；熔解:95℃，1~5min；50℃→72℃每秒收集熒光15~20次，0.02~0.05℃梯度升溫。