[發明專利]一種測定蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法

有效

• 申請號: 201310027640.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103217489A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 朱保國;彭育才;楊嘉明
• 申請（專利權）人: 珠海市麗珠單抗生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術領域

本發明涉及生物技術領域。具體而言，本發明提供了一種測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法。同時本發明還涉及一種免疫球蛋白純化中測定蛋白糖基化和末端修飾情況的試劑盒。

背景技術

近十年來，單克隆抗體在生物醫藥界、乃至整個醫藥行業里取得重大的成功和巨大的發展。與傳統小分子藥物相比，單克隆抗體具有特異性強，療效顯著，副作用小，用量少等優點。就藥物分子特性而言，抗體具有更大的不均一性。抗體的這一特性是由多種因素引起的，翻譯后修飾是其中最重要的內在因素。常見的抗體翻譯后修飾包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脫賴氨酸，脫酰胺，氧化，異構化等。在抗體藥物研發的多個環節，如分子鑒定、工藝開發、質量監控等，均需要對翻譯后修飾進行檢測分析。

抗體IgG糖基化發生在重鏈Fc區的天冬酰胺，屬N-糖基化，是抗體的重要結構組成。IgG糖鏈的核心單元由兩個N-乙酰葡萄糖胺和三個甘露糖的雙叉結構連接組成，根據末端半乳糖、核心巖藻糖、末端唾液酸等的差異，可以組成多種不同的糖鏈結構。IgG的糖基化是不均一的，表現為不同的糖型和含量。糖基化差異可以影響抗體的生物學活性和藥代特征，如CDC、ADCC、體內清除半衰期等。

抗體IgG的N端氨基酸為谷氨酰胺時，容易發生環化反應而生成焦谷氨酸(pyroglutamic?acid，pyroE)。此反應可以自發進行，也可以在酶催化條件下進行。在抗體IgG分子的C端，則容易發生脫賴氨酸(-K)。在大部分情況下，兩者對抗體的生物活性沒有影響，但亦有報道指某些抗體的N端焦谷氨酸化可能會影響其與抗原的結合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸均會影響抗體的電荷分布，而電荷特性是抗體質量監控的重要指標之一。

因此，建立快速檢測抗體IgG糖基化和末端修飾的分析方法在抗體研發中具有重要意義。目前，本領域一般對糖基化和末端修飾單獨進行檢測。酶解熒光標記法是IgG1糖基化測定的經典定量方法，但樣品處理過程相當復雜，耗時長，而且需要樣品量大；也有使用質譜測定IgG酶解片段進行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但這些方法都存在一些不足，如酶切位點選擇性不強，或成本過高，或樣品處理復雜等，不適宜常規或工藝開發樣品的批量檢測。應用LC-MS進行肽圖分析理論上可以同時檢測抗體的糖基化和末端修飾，但含糖多肽的分離、測定和數據分析存在諸多技術難點，不適用于糖基化定量分析，而且樣品處理過程復雜，耗時長，酶切過程也可能對抗體原有末端修飾產生影響。在免疫球蛋白純化過程中，需要對蛋白的純化情況進行隨時檢測，檢測需用樣品量大，檢測耗時長仍是目前最大的問題。因此，目前仍未有適用于抗體研發的對少量IgG的糖基化和末端修飾同時進行快速測定的報道。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種同時測定免疫球蛋白(即抗體)純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法。同時本發明還涉及一種免疫球蛋白純化中測定蛋白糖基化和末端修飾情況的試劑盒。

本發明提供一種同時測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟：

1)使用陽離子交換層析法分離免疫球蛋白，按保留時間收集不同組分；

2)使步驟1)中免疫球蛋白組分經變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；

3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；

4)使用質譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；

5)分析步驟3)中的色譜數據和步驟4)中的質譜數據，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。

其中，所述免疫球蛋白優選為人免疫球蛋白，優選為人免疫球蛋白IgG，進一步優選為人免疫球蛋白IgG1和IgG2亞型。

并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況優選包括免疫球蛋白的輕鏈N端焦谷氨酸化，以及重鏈的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脫賴氨酸。

在本發明提供的測定方法中，所述步驟1)包括：

采用常規強陽離子交換層析柱的上樣緩沖鹽為20mM磷酸鈉緩沖鹽，洗脫緩沖鹽為20mM磷酸鈉和1M氯化鈉緩沖鹽(pH＝6.0)，紫外吸收280nm監測流出組分。