[發明專利]一種測定蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法

有效

• 申請號: 201310027640.7
• 申請日: 2013-01-15
• 公開（公告）號: CN103217489A
• 公開（公告）日: 2013-07-24
• 發明（設計）人: 朱保國;彭育才;楊嘉明
• 申請（專利權）人: 珠海市麗珠單抗生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

1.一種測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，所述方法包括以下步驟：

1)使用陽離子交換層析法分離免疫球蛋白，按保留時間收集不同組分；

2)使步驟1)中免疫球蛋白組分經變性劑變性后，使用還原劑還原，從而拆分輕鏈和重鏈；

3)使用反相超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈；

4)使用質譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量；

5)分析步驟3)中的色譜數據和步驟4)中的質譜數據，從而測定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修飾情況。

2.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟1)采用常規強陽離子交換層析柱的上樣緩沖鹽為20mM磷酸鈉緩沖鹽，洗脫緩沖鹽為20mM磷酸鈉和1M氯化鈉緩沖鹽(pH＝6.0)，紫外吸收280nm監測流出組分。

3.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)包括：向一定量的免疫球蛋白中加入10-30μL的1-6M鹽酸胍水溶液，混合均勻后加入1-4μL二硫蘇糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白發生變性、還原反應，其中，反應溶液中DTT終濃度為25-100mM，免疫球蛋白終濃度為0.2-3μg/μL。

4.根據權利要求3所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中DTT終濃度為50mM。

5.根據權利要求3所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發生變性、還原反應溫度為50-65℃，反應時間為45min-120min。

6.根據權利要求5所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟2)中免疫球蛋白發生變性、還原反應溫度為65℃，反應時間為45min。

7.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟3)包括：采用C4反向超高壓液相色譜分離步驟2)中免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，以實現所述輕鏈和重鏈的基線分離。

8.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟4)包括：

采用電噴霧電離質譜測定步驟3)中獲得的輕鏈和重鏈的分子量，其中在0-5min，流路通往廢液，5-16min，流路通往質譜，然后采用正離子模式采集質譜數據。

質譜條件設定為：

錐孔氣流為50.0L/Hr，脫溶劑氣體為800.0L/Hr，脫溶劑溫度為500℃，錐孔電壓為20-40V，掃描范圍為400-2500Da，掃描時間為1s。

9.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述步驟5)包括：

由步驟3)中獲得的色譜峰面積計算得到所述免疫球蛋白的輕鏈的N端焦谷氨酸化比例，由步驟4)中獲得的質譜數據計算得到所述免疫球蛋白的重鏈的糖型相對含量以及N端焦谷氨酸化和C端脫賴氨酸比例。

10.根據權利要求1所述的測定免疫球蛋白純化工藝過程中樣品的糖基化和末端修飾情況的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白為人免疫球蛋白。