[發(fā)明專利]一種家蠶濃核病毒LAMP可視化快速檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310026869.9
• 申請日: 2013-01-24
• 公開（公告）號: CN103131796A
• 公開（公告）日: 2013-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉吉平;楊吉龍
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種家蠶濃核病毒LAMP可視化快速檢測試劑盒，其特征在于，包括一對內(nèi)側(cè)引物DFI1/?DBI1和一對外側(cè)引物DF1/?DB1，引物序列如SEQ?ID?NO:1~4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含基因組DNA抽提緩沖液、LAMP反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品顯色液；

所述LAMP反應(yīng)液除含有權(quán)利要求1所述引物還含有2×LAMP反應(yīng)緩沖液、Bst?DNA?聚合酶、密封液和無菌水。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述2×LAMP反應(yīng)緩沖液含有20?mM?Tris-HCl，pH8.8；10?mM?KCl；2?mM?MgSO₄；20?mM（NH₄）₂SO₄；0.1%?Triton?X-100；2.8?mM?dNTPs；1M甜菜堿；25mM?MgCl₂。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述DNA抽提緩沖液含有10?mM?Tris-Cl，pH8.?0；0.?1?M?EDTA，pH?8.?0；0.?5%?SDS（十二烷基硫酸鈉）。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述陽性對照品為BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的質(zhì)粒、陰性對照品為正常家蠶組織模板DNA。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述顯色液為SYBR?Green?I?、EvaGreen或鈣黃綠素。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的反應(yīng)體系為：

2×LAMP反應(yīng)緩沖液????????????????????12.5μL；

DFI1/?DBI1（40pmol/μL）???????????????1μL；

DF1/?DB1(5?pmol/μL)???????????????????0.5μL；

Bst?DNA?聚合酶（8U/μL）??????????????1μL；

模板DNA??????????????????????????????2μL；

無菌水?????????????????????????????????8.0μL。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為60~65℃恒溫反應(yīng)20~90?min；然后?80~100℃，1~10?min滅活。

9.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述密封液為甘油。

10.一種用權(quán)利要求1至9任一項所述試劑盒檢測家蠶濃核病毒的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.提取待測樣品DNA；

S2.在反應(yīng)管中配置反應(yīng)體系；

S3.向反應(yīng)體系中加入密封液，在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)加入顯色液；

S4.反應(yīng)：將反應(yīng)管60~65℃恒溫放置20~90?min；然后?80~100℃，放置1~10?min滅活；

S5.結(jié)果判讀：將顯色液與反應(yīng)產(chǎn)物混合；觀察顏色變化，反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色，說明待測樣品含有家蠶濃核病毒；反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌壬瑒t不含有家蠶濃核病毒。