[發(fā)明專利]一種家蠶濃核病毒LAMP可視化快速檢測試劑盒及其檢測方法無效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310026869.9 | 申請日: | 2013-01-24 |
| 公開(公告)號: | CN103131796A | 公開(公告)日: | 2013-06-05 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 劉吉平;楊吉龍 | 申請(專利權(quán))人: | 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號: | C12Q1/70 | 分類號: | C12Q1/70;C12Q1/68 |
| 代理公司: | 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102 | 代理人: | 任重 |
| 地址: | 510642 廣*** | 國省代碼: | 廣東;44 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 一種 家蠶 病毒 lamp 可視化 快速 檢測 試劑盒 及其 方法 | ||
1.一種家蠶濃核病毒LAMP可視化快速檢測試劑盒,其特征在于,包括一對內(nèi)側(cè)引物DFI1/?DBI1和一對外側(cè)引物DF1/?DB1,引物序列如SEQ?ID?NO:1~4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述試劑盒還包含基因組DNA抽提緩沖液、LAMP反應(yīng)液、陽性對照品、陰性對照品顯色液;
所述LAMP反應(yīng)液除含有權(quán)利要求1所述引物還含有2×LAMP反應(yīng)緩沖液、Bst?DNA?聚合酶、密封液和無菌水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒,其特征在于,所述2×LAMP反應(yīng)緩沖液含有20?mM?Tris-HCl,pH8.8;10?mM?KCl;2?mM?MgSO4;20?mM(NH4)2SO4;0.1%?Triton?X-100;2.8?mM?dNTPs;1M甜菜堿;25mM?MgCl2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述DNA抽提緩沖液含有10?mM?Tris-Cl,pH8.?0;0.?1?M?EDTA,pH?8.?0;0.?5%?SDS(十二烷基硫酸鈉)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述陽性對照品為BmDNV模板DNA或含BmDNV靶基因DNA片段的質(zhì)粒、陰性對照品為正常家蠶組織模板DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述顯色液為SYBR?Green?I?、EvaGreen或鈣黃綠素。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的反應(yīng)體系為:
2×LAMP反應(yīng)緩沖液????????????????????12.5μL;
DFI1/?DBI1(40pmol/μL)???????????????1μL;
DF1/?DB1(5?pmol/μL)???????????????????0.5μL;
Bst?DNA?聚合酶(8U/μL)??????????????1μL;
模板DNA??????????????????????????????2μL;
無菌水?????????????????????????????????8.0μL。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒,其特征在于,所述試劑盒的LAMP反應(yīng)條件為60~65℃恒溫反應(yīng)20~90?min;然后?80~100℃,1~10?min滅活。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒,其特征在于,所述密封液為甘油。
10.一種用權(quán)利要求1至9任一項所述試劑盒檢測家蠶濃核病毒的方法,其特征在于,包括如下步驟:
S1.提取待測樣品DNA;
S2.在反應(yīng)管中配置反應(yīng)體系;
S3.向反應(yīng)體系中加入密封液,在反應(yīng)管蓋內(nèi)側(cè)加入顯色液;
S4.反應(yīng):將反應(yīng)管60~65℃恒溫放置20~90?min;然后?80~100℃,放置1~10?min滅活;
S5.結(jié)果判讀:將顯色液與反應(yīng)產(chǎn)物混合;觀察顏色變化,反應(yīng)產(chǎn)物顏色變?yōu)榫G色,說明待測樣品含有家蠶濃核病毒;反應(yīng)產(chǎn)物變?yōu)槌壬瑒t不含有家蠶濃核病毒。
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