[發明專利]一種花藥快速誘導胚性愈傷組織再生植株的方法

無效

• 申請號: 201310026841.5
• 申請日: 2013-01-08
• 公開（公告）號: CN103444523A
• 公開（公告）日: 2013-12-18
• 發明（設計）人: 趙鳳霞;高相彬;王正平;李海峰;宋學立
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院煙草研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于組織培養領域，具體涉及一種通過組織培養誘導葡萄花藥形成胚性愈傷組織的方法。

背景技術

建立穩定高頻的葡萄再生體系對于優化轉基因條件，提高轉基因效率，進行葡萄新品種選育和遺傳改良具有重要意義。以愈傷組織為受體材料進行基因遺傳轉化研究具有很多優勢。第一，已分化的細胞均回復到脫分化的分生細胞水平，易于接受外源基因，轉化效率較高；第二，擴繁量大，獲得的轉化愈傷組織通過繼代擴繁培養，能夠分化出更多的轉化植株；第三，多種組織、器官均可誘導愈傷組織，外植體試材廣泛。目前葡萄再生體系的獲得主要通過兩條途徑：器官再生途徑和體細胞胚再生途徑。器官再生途徑是在外植體上直接形成不定芽、不定根，再生出完整植株，或者外植體經過脫分化誘導產生愈傷組織，愈傷組織在分化培養基上分化從而獲得再生植株。該途徑再生過程簡單，周期短，但是容易產生嵌合體。體細胞胚再生途徑是由植物組織直接分化出體細胞胚或者植物組織先誘導產生愈傷組織，愈傷組織經過誘導形成體細胞胚。由花藥、花絲、胚珠等器官誘導胚性愈傷組織產生體細胞胚是葡萄再生體系研究中效果最好、應用最廣泛的誘導方式。誘導過程存在胚性愈傷組織誘導效率低，伴隨著非胚性愈傷組織的出現，培育周期長等，限制了葡萄花藥培養在實際育種中的應用。因此提高葡萄胚性愈傷組織的誘導率是葡萄花藥培養技術研究中一個關鍵問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有的葡萄花藥誘導胚性愈傷組織誘導率低的不足，提供一種高效誘導葡萄花藥形成胚性愈傷組織進而再生葡萄植株的培養基配方及誘導方法，通過該方法提高胚性愈傷組織的誘導率，為建立高效的葡萄花藥培養植株再生系奠定基礎。

本發明通過以下技術方案實現：

葡萄花藥快速誘導胚性愈傷組織再生植株的方法：利用釀酒葡萄雷司令花藥為材料，進行花藥誘導胚性愈傷組織、愈傷組織分化培養、分化苗生根培養、煉苗移栽等步驟完成葡萄植株再生。根據該方法，其特征在于葡萄盛花前12-14天，即花粉四分體到單核期，在天氣晴朗的上午摘取花藥飽滿的花蕾，4℃黑暗保存3天，可以提高胚性愈傷組織的誘導效率；從消過毒的花蕾中取出花藥在無菌條件下接種到愈傷組織誘導培養基中，愈傷組織誘導培養基配方為：MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.2mg?L^-1煙酸、150mgL^-1肌醇、2.0mg?L-¹P-CPA，0.20mg?L^-1TDZ，5mg?L^-1AgNO₃，10mg?L^-1慶大霉素，100mg?L^-1半胱氨酸，50mg?L^-1水解酪蛋白、3％葡萄糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH?6.2。將胚性愈傷組織接種到組織分化培養基上進行分化誘導，組織分化培養基為：MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.5mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.2mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mg?L^-1煙酸、150mg?L^-1肌醇、1.0mg?L^-1P-CPA，0.20mg?L^-1TDZ，0.5mg?L^-1NOA，0.01mg?L^-1GA₃、50mg?L^-1水解酪蛋白、2.0mg?L^-1甘氨酸、10g?L^-1椰乳、5％蔗糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH?6.2。培養條件為溫度25℃，濕度70％，光照1000-1500lux，光照時間12小時/天。將分化苗轉入生根培養基誘導生根，生根培養基成分為1/2MS大量元素、MS微量元素、MS鐵鹽、0.1mg?L^-1鹽酸硫胺素、0.8mg?L^-1鹽酸吡哆醇、0.5mgL^-1煙酸、100mg?L^-1肌醇、0.5mg?L^-1α-萘乙酸鈉、0.5mg?L^-1NOA、50mg?L^-1水解酪蛋白、2.0mg?L^-1甘氨酸、3％葡萄糖和0.28％脫乙酰吉蘭糖膠，pH?6.2。培養條件為先在光下培養一周，再暗培養一周，再在光下培養至正常生根，溫度25℃，濕度70％，光照1500-2000lux，光照時間12小時/天；當苗基部長出3-4條根，根長3cm時打開瓶蓋，環境溫度25℃，濕度85％，光照強度2000lux，煉苗5天；然后取出組培苗，自來水洗凈根部培養基，移栽到滅過菌的珍珠巖基質中，1/8MS營養液澆透后，每周澆灌一次培養液，加蓋與營養缽相同大小的上端剪口的塑料袋保持適度，25℃室內培養1個月，后移栽到大田。