[發明專利]一種同時檢測動物血漿中青蒿琥酯及二氫青蒿素含量的方法

無效

• 申請號: 201310024689.7
• 申請日: 2013-01-23
• 公開（公告）號: CN103940918A
• 公開（公告）日: 2014-07-23
• 發明（設計）人: 李冰;張繼瑜;周緒正;牛建榮;魏小娟;李金善;李劍勇;楊亞軍;劉希望;張杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 馬正良

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技術領域

本發明屬于藥物分析領域涉及一種運用固相萃取前處理技術和高效液相色譜-串聯質譜聯用（HPLC-MS/MS）法同時測定動物血漿中青蒿琥酯及二氫青蒿素含量的方法。

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背景技術

在亞洲和非洲國家青蒿素及其衍生物青蒿琥酯等被廣泛用于瘧疾的治療，特別是惡性瘧原蟲的治療。青蒿琥酯及其在體內的代謝產物二氫青蒿素血藥濃度的檢測方法在國內未見報道。目前報道的青蒿琥酯含量的檢測方法主要有HPLC-UV檢測、電化學檢測、HPLC-蒸發光檢測。但由于青蒿琥酯的分子結構決定了它的紫外吸收很弱，紫外檢測限高，很難滿足生物樣品檢測的要求，并且檢測方法復雜，操作困難。為了解決血漿樣品中青蒿琥酯及二氫青蒿素的含量測定問題，必須同時在生物樣品前處理過程和分析檢測技術中尋求突破，提高檢測的靈敏度和準確性。

固相萃取技術是一種樣品預處理技術，由液固萃取和柱液相色譜技術相結合發展而來，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預處理過程，得到高純度和濃縮的分離物。

HPLC—MS/MS(液相色譜-串聯質譜)聯用技術是當前比較新穎的技術，因其結合了液相色譜的高效分離能力和質譜的準確定性能力，近年來成為最可靠實用的分析手段。該分析技術需樣量少、檢測限低，尤其適用于藥物在機體代謝等因素的作用下所產生的分解物或代謝物的結構研究和量的變化。

發明內容

鑒于上述，本發明的目的在于提供一種同時檢測動物血漿中青蒿琥酯及二氫青蒿素含量的測定方法。該方法將固相萃取前處理技術與高效液相色譜-串聯質譜聯用技術聯合使用，成功排除了復雜生物樣品體系中雜質對青蒿琥酯及二氫青蒿素含量測定的干擾，能準確的同時測定動物血漿中青蒿琥酯及二氫青蒿素的含量。

本發明目的是通過以下技術方案來實現：

一種同時檢測動物血漿中青蒿琥酯及二氫青蒿素含量的方法，其步驟是：

a.?精密稱取青蒿琥酯標準品、二氫青蒿素標準品，分別置于棕色容量瓶中，用色譜甲醇或乙腈配制得標準品溶液；精密稱取青蒿素標準品，置于棕色容量瓶中，用色譜甲醇或乙腈配制得內標溶液；

b.?取動物空腹靜脈血漿，加入上述a得到的標準品溶液和內標溶液，渦旋混合40-50s，得血漿樣品；取給藥后的動物血漿，加入內標溶液，渦旋混合40-50s，得供試樣品；

c.?將b步驟所得的血漿樣品和供試樣品分別加入2倍體積乙腈沉淀蛋白，渦旋震蕩30-40s，離心，取上清液；

d.?固相萃取小柱處理（Waters?Oasis?HLB固相萃取小柱），加1ml甲醇和1ml?1M醋酸沖洗，再用1ml甲醇沖洗，備用；

e.?將c步驟得到的上清液分別上處理好的固相萃取小柱，用1M醋酸和20%甲醇醋酸溶液沖洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷(V:V=2:3)洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，殘渣用甲醇或乙腈溶解，即得標準血漿溶液和供試品溶液，備用；

f.?高效液相色譜-串聯質譜聯用（HPLC-MS/MS）測定供試品溶液，測定條件用碳十八烷基鍵合硅膠固定相色譜柱，流動相A:B=60:40（v:v），其中A:乙腈；B：純凈水（1mmol乙酸銨，0.1%甲酸，0.02%乙酸），流速0.4mL·?min^-1，電噴霧離子化（ESI）模式，正（+）離子多反應監測，毛細管出口端電壓：45v；碰撞能量：25v；deta?EMV+：200v；干燥氣體（N₂）流速10L·min^-1，噴霧器30psi，氣體溫度350℃，毛細管電壓?4000?V。

g.?將e得到的標準血漿溶液和供試品溶液按f所述色譜質譜條件進樣，得到總離子流圖和質譜圖，測定峰面積。分別以青蒿琥酯和二氫青蒿素濃度（X）為橫坐標，青蒿琥酯、二氫青蒿素分別與內標青蒿素的峰面積比值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程，計算待測物濃度。

上所述固相萃取小柱填料可為鍵合硅膠填料，或為聚合物吸附填料，或為石墨碳反相填料。

上述固相萃取小柱填料為由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體聚合成的大孔共聚物填料。

上述動物可為羊，牛。

本發明的優點：

1、本發明采用對供試樣品應用固相萃取技術處理后，復雜生物樣品中微量的被測組分萃取完全并達到了很好的富集，得到了高純度和濃縮的分離物。方法可靠，回收率在95%左右，RSD(%)小于3%，滿足分析檢測要求。