[發明專利]一種負載小干擾RNA的納米級脂質微泡超聲造影劑及制備方法

有效

• 申請號: 201310024514.6
• 申請日: 2013-01-23
• 公開（公告）號: CN103100093A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 鄭榮琴;尹庭輝;帥心濤
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: A61K49/22
• 分類號: A61K49/22;A61K48/00;A61K47/34;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

技術領域

本發明涉及超聲分子影像學和生物醫學工程領域，具體地，涉及一種負載小干擾RNA（siRNA）的納米級脂質微泡超聲造影劑及其制備方法。

背景技術

超聲造影作為超聲成像技術中的第三次革命，為多種疾病特別是腫瘤性疾病的診斷及鑒別診斷提供了有效的依據。隨著超聲成像技術的快速發展，發現微泡一方面在超聲造影中能夠作為顯影劑，另一方面能夠作為超聲空化效應的空化核，降低空化效應的閾值，促進基因片段的靶向遞送。大量研究證明，以微氣泡作為空化核心，在低頻率高能量超聲輻照下，能夠產生空化效應，在此過程中釋放出巨大的能量、高溫、高壓和噴射流。在空化效應的作用下，微泡周圍的細胞膜被瞬間打開，產生半衰期為20至50毫秒的裂孔，然后迅速閉合，這種效應被稱為“聲孔效應”。通過被打開聲孔的細胞膜，細胞周圍的基因片段在空化效應的作用下被動地遞送到胞漿中，實現基因的細胞遞送。這種通過空化效應和聲孔效應實現的靶向基因遞送體系稱為超聲靶向微泡破壞（UTMD）技術。目前，應用于UTMD技術進行基因遞送的微泡主要是商品化的微泡造影劑，如聲諾維等。

但是，商品化的微泡具有作為基因遞送載體（特別是腫瘤靶向基因遞送載體）存在著明顯的不足：①直徑過大，因目前市面上的超聲造影劑都是微米級別的，只能局限于血管系統內，無法通過腫瘤血管內皮間隙到達腫瘤細胞周圍；②不能負載基因片段，由于市面上的微泡均為表面帶負電的微泡，而基因片段（質粒DNA，siRNA等）表面均帶有負電，二者無法有效結合。因此，目前商品化的微泡超聲造影劑不能稱為嚴格意義上的基因載體。

為了高效遞送基因片段及實現腫瘤靶向基因傳輸，有必要制備一種新型的超聲造影劑作為基因載體，并同時解決一下技術難題。①粒徑小，處于納米級，能夠通過腫瘤增寬的血管內皮間隙(380?～780?nm)實現造影劑的腫瘤被動靶向聚集；②能夠高效負載基因片段，使其負載在微泡造影劑內，實現造影劑與基因片段的同步遞送；③具有良好的增強超聲顯影能力，在診斷超聲條件下實現超聲造影的應用；④具有超聲敏感性，在低頻高能量超聲輻照的條件下激發微泡的空化效應，實現基因片段的靶向釋放。

發明內容

本發明的目的在于針對目前現有的超聲造影劑作為siRNA載體存在的不足，提供一種能夠負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑（下文簡稱siRNA納米微泡）。

本發明的另一目的在于提供上述微泡造影劑的制備方法。

本發明通過以下技術方案來實現上述目的：

一種負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑，所述造影劑能夠高效負載siRNA，siRNA被負載在整個微泡結構的表面，與納米級脂質微泡超聲造影劑形成整體；所述負載siRNA的納米級脂質微泡的直徑為200～500?nm。

如上所述造影劑是通過正負電荷吸引力，將表面帶正電的siRNA納米膠束負載在表面帶負電的納米級脂質微泡超聲造影劑表面，形成一個整體結構。

???一種如上所述負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑的制備方法，具體包括如下步驟：

S1.以磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸為膜材，通過薄膜-水化法制備得到帶負電的納米級脂質微泡超聲造影劑；

S2.將聚乙二醇（Polyethyeneglycol，可簡寫為PEG）與聚賴氨酸（Polylysine，可簡寫為PLL）組成兩嵌段陽離子共聚物與siRNA以氮磷比（共聚物的含氮基團與siRNA的含磷基團的摩爾比）的比值為2~8：1時進行自主裝，得到帶正電的siRNA納米膠束；

S3.在S1得到的帶負電的納米級脂質微泡中加入過量S2中帶正電的siRNA納米膠束，孵育制備得到負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑。

具體地，步驟S1中所述薄膜-水化法制備得到帶負電的納米級脂質微泡超聲造影劑的步驟如下：

S11.將磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC），二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE），二棕櫚酰磷脂酸（DPPA）溶解于氯仿中并置于培養皿中，

S12.在通風櫥中待氯仿自然揮發形成磷脂薄膜，加入雙蒸水37~60℃水化0.5~2小時后，將脂質溶液轉移到離心管中，利用超聲破碎儀進行聲振1~10分鐘，同時通入八氟丙烷氣體制備脂質微泡；

S13.將微泡液靜置10~30分鐘，然后以1000?~2000rpm離心1~10分鐘，吸取下層乳白色液體即為所制備的表面帶負電的納米微泡。