[發明專利]一種負載小干擾RNA的納米級脂質微泡超聲造影劑及制備方法

有效

• 申請號: 201310024514.6
• 申請日: 2013-01-23
• 公開（公告）號: CN103100093A
• 公開（公告）日: 2013-05-15
• 發明（設計）人: 鄭榮琴;尹庭輝;帥心濤
• 申請（專利權）人: 中山大學附屬第三醫院
• 主分類號: A61K49/22
• 分類號: A61K49/22;A61K48/00;A61K47/34;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 謝敏楠

1.一種負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑，其特征在于，?siRNA被負載在微泡結構的表面，所述負載siRNA的納米級脂質微泡的直徑為200～500?nm。

2.一種負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于，所述造影劑是通過正負電荷吸引力，將表面帶正電的siRNA納米膠束負載在表面帶負電的納米級脂質微泡超聲造影劑表面，形成一個整體結構。

3.一種負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟：

????S1.以磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸為膜材，通過薄膜-水化法制備得到帶負電的納米微泡超聲造影劑；

S2.?將聚乙二醇與聚賴氨酸組成兩嵌段陽離子共聚物與siRNA以氮磷比的比值為2~8：1時進行自主裝，得到帶正電的siRNA納米膠束；所述氮磷比是指共聚物的含氮基團與siRNA的含磷基團的摩爾比；

S3.在S1得到的帶負電的納米級脂質微泡中加入過量S2中帶正電的siRNA納米膠束，孵育制備得到負載siRNA的納米級脂質微泡超聲造影劑。

4.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S1中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數比為18：1：1~5。

5.根據權利要求4所述制備方法，其特征在于，S1中所述二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸的重量份數比為18：1：1。

6.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S1中所述薄膜-水化法具體步驟如下：

S11.將磷脂成分二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰乙醇胺和二棕櫚酰磷脂酸溶于氯仿中；

S12.待氯仿自然揮發形成磷脂薄膜后加入雙蒸水37~60℃水化0.5~2小時后，超聲聲振1~10分鐘，同時通入八氟丙烷氣體制備脂質微泡；

S13.將微泡液靜置10~30分鐘，離心，吸取下層乳白色液體即為所制備的表面帶負電的納米級脂質微泡超聲造影劑。

7.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S1中所述帶負電的納米級脂質微泡內含八氟丙烷氣體。

8.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S2中所述聚乙二醇的分子量為500~3500；所述聚賴氨酸的平均分子量為6000~10000。

9.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S2中所述聚乙二醇與聚賴氨酸組成兩嵌段陽離子共聚物的具體步驟為：

????S21.由甲氧基聚乙二醇制備得到大分子引發劑α-甲基-ω-氨基的聚（乙二醇）；

????S22.由賴氨酸鹽酸鹽合成芐氧羰基保護賴氨酸酸酐；

????S23.聚（乙二醇）-b-聚（芐氧羰基-賴氨酸）嵌段共聚物的制備：以α-甲基-ω-氨基的聚（乙二醇）作為大分子引發劑，通過引發芐氧羰基保護的賴氨酸酸酐的開環聚合反應合成的；具體步驟為在氬氣保護下，向反應瓶中，加入α-甲基-ω-氨基的聚（乙二醇）0.5~2克和芐氧羰基保護賴氨酸酸酐6~10克，用無水二甲基甲酰胺溶解后，放在33~37?℃油浴反應2~4天；反應結束后，將反應體系用乙醚沉淀，過濾，洗滌，室溫下在真空干燥，得到的白色粉末；

????S24.雙嵌段共聚物聚（乙二醇）-b-聚（L-賴氨酸）的制備：將S23中共聚物聚（乙二醇）-b-聚（芐氧羰基-賴氨酸）溶解在三氟乙酸中，冰浴條件下，加入溴化氫的冰醋酸溶液；室溫下攪拌后，用過量乙醚洗滌反應體系洗滌；在蒸干溶劑后，室溫下在真空干燥，得到灰色的終產物粉末。

10.根據權利要求3所述制備方法，其特征在于，S3中所述孵育后利用高速離心法純化產物，即用500~3000?rpm離心20~40分鐘，棄去下層清液，加入雙蒸水重懸，反復洗滌三遍，最后用磷酸鹽緩沖液重懸得終產物。