[發明專利]一種高產L-苯丙氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及其應用

有效

• 申請號: 201310023160.3
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103074292A
• 公開（公告）日: 2013-05-01
• 發明（設計）人: 陳堅;張傳志;堵國成;康振
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/22;C12R1/15
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發明涉及一種高產L-苯丙氨酸的重組谷氨酸棒桿菌及其應用，特別是一種代謝改造的重組谷氨酸棒桿菌及其生產L-苯丙氨酸的方法。

背景技術

苯丙氨酸(Phenylalanine)，即D,L-α-氨基-β-苯基丙酸，有外消旋DL-型、L-型和D-型三種，其中具有生物活性的光學異構體為L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine,L-Phe)，比旋光度為-35.1°。L-Phe又名L-苯基-氨基丙酸，常溫下為白色或無色結晶性粉末固體，水中溶解度為29.6g/L，難溶于甲醇、乙醇和乙醚。L-Phe在自然界中廣泛存在于卵、乳和動物蛋白中，含量5%-6%；L-Phe也存在于植物性蛋白質中，含量約為1%。

L-Phe是人和動物體內不能合成的8種必需氨基酸之一，也是高甜度低熱量的新型甜味劑阿斯巴甜的重要組成部分。作為一種重要的生物化工產品，L-Phe在食品、飼料添加劑以及醫藥等領域具有廣泛的應用。

20世紀80年代以來，隨著氨基酸類抗癌藥物和營養保健品的開發應用，尤其是阿斯巴甜的廣泛生產與使用，國際市場對L-Phe的需求快速增長。據悉，2005年全球需求量為3萬噸，實際年產量只有1.4萬噸，而2006年L-Phe的需求量已達到10萬噸左右，且有逐年上漲的趨勢。隨著市場需求的不斷增長，L-Phe的生產受到越來越多的關注。L-Phe主要由化學合成法、酶法和微生物發酵法等3種方法來生產。化學合成法因其生產路線長、副產物多、且產物為消旋體不宜推廣使用。酶法主要是由化學合成的類氨基酸前體經過微生物細胞內酶系高效專一地催化合成L-Phe。酶法生產工藝簡單、產物濃度較高、純化步驟簡便且生產能力較強，是目前工業化生產L-Phe的主要方法之一。近年來，由于底物和酶等主要原料成本高、來源有限，反應過程中酶穩定性差等缺點，酶法生產L-Phe也受到了很大制約。發酵法是指利用微生物由碳源和氮源大量生產L-Phe的一種方法，具有原料廉價易得、環境污染較小、產物純度高等優點。實際上，早在20世紀60年代，日本中山公司用糖質發酵制備L-Phe獲得了成功，并由協和發酵公司實現了工業化生產。隨著代謝工程、發酵工程等相關技術的不斷發展，發酵法生產L-Phe受到國內外研究者的關注并得到了廣泛深入的研究，成為目前國內外工業化生產L-Phe的主要方法。

L-Phe、L-酪氨酸(L-Tyr)和L-色氨酸(L-Trp)屬于芳香族氨基酸，只能由植物和微生物合成。可用于生產L-Phe的微生物包括大腸桿菌(Escherichia?coli)、枯草桿菌(Bacillus?subtilis)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium?glutamicum)、黃色短桿菌(Brevibacteriumflavum)、乳酸短桿菌(Brevibacterium?glutamicum)和乳糖發酵短桿菌(Brebibacterium?lactofermentum)等。其中E.coli和C.glutamicum是發酵法生產L-Phe的主要菌種。在C.glutamicum中，以葡萄糖為底物的L-Phe生物合成途徑如圖1-2所示。其中，由磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和4-磷酸赤蘚糖(E4P)在3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸合成酶(DAHP?synthases,DS)的催化下縮合生成3-脫氧-D-阿拉伯庚酮糖酸7-磷酸(DAHP)的反應為第一個限速反應。在C.glutamicum中DS酶僅由aroG編碼，在Escherichia?coli?DS酶由三種基因aroF、aroG和aroH所編碼，酶活組成比例為aroF：aroG：aroH＝80：1：20。第二和第三個限速反應分別為由分支酸在分支酸變位酶(Chorismate?mutase,CM)的作用下轉變為預苯酸，繼而在預苯酸脫水酶(Prephenate?dehydratase,PDT)的作用下脫水、脫羧后形成PPA。CM和PDT是由pheA基因編碼的雙功能酶，受到產物L-Phe的反饋抑制。pheA基因的表達受到操縱子介導的阻遏和衰減調控。此外，L-Phe合成和轉運有關的酶的表達還受到調控基因tyrR編碼的阻遏蛋白TyrR的反饋阻遏。

發明內容