[發明專利]用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物及其制備方法和應用

無效

• 申請號: 201310021667.5
• 申請日: 2013-01-22
• 公開（公告）號: CN103083651A
• 公開（公告）日: 2013-05-08
• 發明（設計）人: 劉睿;吳皓;程建明;卞慧敏;王令充
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: A61K38/48
• 分類號: A61K38/48;A61K47/48;A61K47/42;A61P17/00;C07K19/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

技術領域

本發明涉及一種肉毒毒素的制劑，具體涉及一種穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物及其制備方法和其應用，應用于經皮給藥系統和化妝品領域。

背景技術

穿膜肽是一些具有細胞膜穿透能力的小分子多肽，長度一般不超過30個氨基酸，可攜帶比其分子質量大100倍的外源性疏水大分子進入細胞，毒副作用小。穿膜肽可以通過共價鍵或非共價鍵等方式攜帶生物大分子物質透過細胞膜，如將蛋白質類、多肽類等大分子生物活性物質遞送進入細胞內從而發揮治療作用。

肉毒毒素是肉毒桿菌產生的毒素，具有強烈的神經毒性，其生物學作用是在神經肌接頭處阻滯神經末梢釋放乙酰膽堿，從而治療痙攣、強直等疾病。自1992年報道肉毒毒素在治療眼肌痙攣時，同時具有消除皺紋的作用，從此開創了肉毒毒素在美容領域的應用。2002年4月FDA批準肉毒毒素可以用于化妝品中，其效果顯著、安全性高的特點受到廣泛關注。目前肉毒毒素的主要給藥途徑為皮下注射或肌肉注射，肉毒毒素注射劑通過在面部肌肉內注射起到去除皺紋的治療效果，面部肌肉包括皺眉肌、降眉肌、眼輪匝肌、顳肌等，目前對于注射用肉毒毒素在臨床的使用的安全性和耐受性存在一定問題，且存在患者使用的順應性不好等問題。

因此，急需將肉毒毒素開發為新型的經皮給藥制劑，基于穿膜肽的經皮轉運作用，能促進肉毒毒素穿過皮膚屏障，達到作用部位，用于治療包括眉間皺紋、鼻唇線、魚尾紋、嘴角紋和抬頭紋等，提高藥物使用的安全性和順應性，降低藥物的毒副作用及耐受性。

現有研究通過將A型肉毒毒素與HIV-TAT穿膜肽進行組合，用于A型肉毒毒素的局部施用和透皮遞送，但是任然存在透皮吸收率差，應用范圍較差等缺點。因此，為了進一步地提高肉毒毒素的透皮吸收率，很有必要在現有技術的基礎上設計研發一種透皮吸收率更高的肉毒毒素的外用經皮給藥制劑。

發明內容

發明目的：本發明的目的是解決現有技術的不足，通過大量實驗篩選，提供一種高效透過率的穿膜肽與肉毒毒素進行組合，或將穿膜肽與肉毒毒素形成融合蛋白的方式，獲得高透過率的穿膜肽介導的肉毒毒素外用經皮給藥制劑。

技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

一種用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，所述穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在或者穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在。

作為優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，穿膜肽通過與肉毒毒素組合的形式存在時，所述的穿膜肽的氨基酸序列為精氨酸的直鏈聚合物R_n，其中n?=?3~16。本發明通過大量實驗，篩選了大量不同的氨基酸序列，實驗結果表明，當肉毒毒素與精氨酸的直鏈聚合物R_n（其中n?=?3~16）組合時，肉毒毒素的透皮轉運速率與透過率顯著高于現有技術的肉毒毒素經皮給藥系統。

作為另一優選方案，以上所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為精氨酸的直鏈聚合物R_n，其中n?=?3~16。作為另一更優選方案，穿膜肽通過與肉毒毒素形成融合蛋白的形式存在時，所述的穿膜肽的序列為具有HIV-1轉錄激活因子Tat蛋白轉導結構域Tat-PTD_49-57序列片段。

作為優選方案，穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質，具體方法為：采用PCR方法擴增出穿膜肽與A型肉毒毒素的基因片段，采用overlap法連接后將擴增產物和大腸桿菌表達質粒pET-22b用限制性內切酶EcoR?I以及Xho?I雙酶切后連接，并轉化至大腸桿菌DH5α中，用氨芐青霉素篩選陽性克隆，抽提經測序鑒定正確的重組質粒，轉化至大腸桿菌BL21中，利用氨芐青霉素抗性篩選出構建成功的轉化子，在37℃經IPTG誘導4小時后，收獲融合蛋白并使用Ni親和層析柱進行分離純化，獲得穿膜肽與A型肉毒毒素的融合蛋白。

穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質，其中所述肉毒毒素融合蛋白質以約5單位到約為3000單位的量存在于所述的外用經皮給藥制劑中。

為了更好的促進肉毒毒素的透皮轉運與透過，本發明通過大量實驗篩選研究，結果表明，當穿膜肽與肉毒毒素通過基因重組方式獲得的融合蛋白質時，其透皮轉運速率與透過率得到明顯提高，取得了非常好的技術效果。

作為優選方案，所述的用于外用制劑的穿膜肽介導的肉毒毒素的組合物，所述的肉毒毒素未A、B、C、D、E、F或G型肉毒毒素。